PLGA纳米-微球作为核酸载体的研究进展(1)

微生物学通报DEC20,2009,36(12):1901~1908Microbiology©2009byInstituteofMicrobiology,[e-mail]基金项目：欧盟项目FMD-DISCONVAC(No.226556);家畜疫病病原生物学国家重点实验室自主研究课题(No.SKLVEB2008ZZKT008);甘肃省自然科学基金(No.0710RJZA082)*通讯作者：Tel:[phone];E-mail:[e-mail]收稿日期：2009-06-11;接受日期：2009-08-31专论与综述PLGA纳米/微球作为核酸载体的研究进展王刚潘丽张永光*(中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室农业部畜禽病毒学重点开放实验室甘肃兰州730046)摘要:生物可降解材料[poly(lactide-co-glycolideacid),PLGA]颗粒在持续释放和定位递送各种药剂包括核酸有很大的研究和应用价值。本文综述了PLGA作为核酸载体的制备及其用于基因载体和疫苗佐剂的研究。关键词:PLGA,DNA,基因治疗,疫苗佐剂ResearchProgressonPLGANanoparticles/MicrospheresasDNACarriersWANGGangPANLiZHANGYong-Guang*(KeyLaboratoryofAnimalVirologyofAgriculture/StateKeyLaboratoryofVeterinaryEtiologicalBiology,LanzhouVeterinaryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Lanzhou,Gansu730046,China)Abstract:BiodegradablePLGA[poly(lactide-co-glycolideacid)]haveshownsignificantpotentialforsus-tainedandtargeteddeliveryofseveralpharmaceuticalagents,includingDNA.WereviewedtheformulatingapproachesofPLGAnanoparticles/microspheresasDNAcarriersandutilizationforgenetherapyandvac-cineadjuvant.Keywords:PLGA,DNA,Genetherapy,Vaccineadjuvant生物可降解材料PLGA是乳酸(Lacticacid,LA)与羟基乙酸(Glycolicacid,GA)共聚合而成,有很好的稳定性,具有易于被吞噬细胞摄取,通过在颗粒表面吸附相应的配体可以定位到特定的组织或器官等优点,美国食品药品管理局(FDA)已认定PLGA有良好的生物相容性和安全性,已被广泛应用于人的临床医学[1,2]。由于制备工艺不同,PLGA分子量、LA与GA的摩尔比、光学活性、链末端结构不同,都会影响PLGA的释放特性。PLGA可以通过改变自身共聚物中LA与GA的比例而改变PLGA的物理化学性质[3]。DNA包裹进PLGA有4个优点[4,5]:1)防止体内DNA降解;2)起到控制释放的作用,并长期刺激树突状细胞(Dentriticcell,DC);3)易于转化动物细胞,易于被DC细胞吞噬;4)在抗原存在时,能够刺激Th1型免疫反应。1载核酸PLGA颗粒制备及其对转化的影响颗粒的直径和表面电势是两个重要的物理参数,它影响着核酸的包裹率、转化率。1902微生物学通报2009,Vol.36,No.12颗粒的直径PLGA一般制备成微粒或纳米粒,而微粒或纳米粒是根据它的直径来分类的,微球的直径在1µm到250µm,而纳米粒直径则在1nm到1000nm[4]。纳米粒相对微粒有更高的吸收率,研究表明在人结肠腺癌细胞(Caco-2)中,100nm的纳米粒相对1µm的微球吸收率提高2.5倍,相对10µm微球的吸收率提高6倍[6]。在小鼠肠管原位模型中(Aratinsituintestinalloopmodel)也得到了相似的结果,100nm的纳米粒相对1µm和10µm微球的吸收率提高15到250倍[7]。当颗粒通过黏膜部位摄取时,小的颗粒能够穿过黏膜下皮层,而大的颗粒则定位于黏膜上皮层,且小的颗粒比大的颗粒有更高的转化效率[7,8]。一系列的研究表明,颗粒直径显著影响细胞和组织的吸收效率,且更小、更均一的粒径会使基因的表达效果提高。1.2制备技术对颗粒的影响1.2.1制备方法对颗粒的影响:制备微粒或纳米粒的方法很多,包括乳化溶剂挥发法(Emulsionsolventevaporationtechnique)[9]、乳化溶剂扩散法(Emulsionsolventdiffusionmethod)[10,11]、喷雾干燥法(Spraydrying),复乳化溶剂挥发法(Doubleemulsionsolventevaporation,DES-E)[12,13],复乳化溶剂扩散法(Doubleemulsionsolventdiffusiontechnique)[14]等。复乳化溶剂挥发法是最常用于制备DNA包裹PLGA的方法(图1)。而这些方法的选择取决于所需要的颗粒直径和包裹率。以聚合物为原料制备微球最常用的方法是先制备成O/W、W/O、W/O/W、O/W/O等型乳液后,再根据具体的用途选择适当方法使液滴固化成微球。制备方法的选择对颗粒直径有直接的影响。固化一般采用冷冻干燥或喷雾干燥的方法,发现喷雾干燥可以降低颗粒聚集,从而制备出直径更小的颗粒,因而喷雾干燥技术越来越被广泛采用。以冷冻干燥和喷雾干燥的方法制备含阳离子PLGA,图1以W/O/W复乳化溶剂挥发法来制备载质粒DNA的PLGA纳米球[15]Fig.1PreparationmechanismofpDNAloadedPLGAnanospherebyW/O/Wemulsionsolventevaporationmethod[15]比较其颗粒直径,结果显示喷雾干燥制备的纳米球显著小于冷冻干燥制备的纳米球[16](表1)。载质粒DNA的PLGA颗粒可以通过两种方法来制备,一种是把DNA包裹在PLGA里[17,18],另一种是把DNA吸附在PLGA颗粒的表面[19]。吸附DNA于PLGA颗粒上,可以增强DNA与TLR受体的作用,可以提高包裹效率[20]。1.2.2搅拌对颗粒的影响:在制备PLGA颗粒过程中,当有机相和水相混合后,需要使之混均匀,这时一般采用两种方法:超声波法(Sonication)和匀浆法(Homogenization)[4]。超声波的优点是能够制备相对较小且均一的颗粒,但是在包裹法制备PLGA颗粒时容易导致DNA的断裂和潜在的24h内的突释效应。匀浆法是在表面活性剂存在时以高频振动来乳化聚合物和DNA混合物。和超声波法相比,匀浆法需要更高浓度的表面活性剂(5%vs.1%)和添加复合溶剂。即使通过以上改进,匀浆法制备的颗粒仍然比超声波法制备的颗粒直径略大(~450nmvs.~280nm),但却有更高的包裹率,通过匀浆法制备的颗粒比超声波法制备的颗粒有更慢、更一致的DNA释放模式[4]。使用匀浆法时,当增加匀浆速度时,颗粒直径相应减小,但当速度在12000rpm以上时,变化很小[21]。1.2.3有机相与水相的比例对颗粒的影响:有机相与水相的比例对于颗粒的直径和表面电势都有很大表1冷冻干燥或喷雾干燥前、后阳离子PLGA纳米球的平均直径和喷雾干燥后的电势Table1Meanparticlediameter(D50)ofPLGAnanosphereswithcationicmaterialsbeforeandafterfreeze-dryingorspray-drying,andzetapotentialafterspray-drying阳离子聚合物Cationicmaterials干燥前BeforedryingD50(nm)冷冻干燥Freeze-driedD50(nm)喷雾干燥Spray-driedD50(nm)电势Zetapotential(mV)PEI99.8342.6124.157.2CTAB216.81281.2219.1−7.5王刚等:PLGA纳米/微球作为核酸载体的研究进展1903表2匀浆法和超声波法比较Table2Compareformulatingmethodbetweensonicationandhomogenization颗粒直径(nm)Particlediameter包裹率DNA-loadingrate释放模式ThepatternofreleaseDNA稳定性DNAstability匀浆法Homogenization~450高慢,一致好超声波法Sonication~280低快,不一致差的影响,当它们的比例从2:1到1:1,1:2变化时,颗粒直径变小,而表面电势增大[8]。1.3PLGA性质对颗粒的影响PLGA的LA与GA的比例对颗粒的直径和表面电势也有影响,在相同的条件下,PLGA75:25比PLGA50:50有更小的纳米颗粒直径,更高的表面电势[22]。PLGA50:50的分子量(12kD,53kD,143kD)越高,制备的纳米颗粒直径越小,表面电势越高[22]。用疏水的PLGA(Mw31000)比亲水的、小分子量(Mw10000)的PLGA有较高的pDNA–PLL包裹率(46.2%)和pDNA的超螺旋结构(64.9%)[23]。含pDNA–PLL的小分子量和亲水PLGA微球在38天的体外释放率分别为95.9%和84.9%,而疏水、高分子量的PLGA则为54.2%[23]。PLGA的浓度也影响颗粒的大小,当浓度增加时,PLGA纳米颗粒直径增大,但对表面电势的影响很小[8]。1.4表面活化剂对颗粒的影响利用聚乙烯醇(Polyvinylalcohol,PVA)和聚乙烯吡咯烷酮(Polyvinylpyrrolidone,PVP)作稳定剂,当PVA浓度从1%增加到7%时,颗粒直径从6.6µm降低到2.2µm[23]。在相同浓度稳定情况下,PVA制备的微球pDNA–PLL包裹率是46.2%,而PVP为24.1%[23]。在制备壳聚糖包被的PLGA纳米粒时,以PVA作稳定剂,同样随浓度增加颗粒的直径减小[8]。以PEG作为稳定剂,可以提高PLGA纳米球中DNA的完整性和提高包裹效率[24]。1.5共聚物对颗粒的影响添加一些阳离子共聚物如左旋聚赖氨酸[poly(L-lysine),PLL][25]、聚乙烯亚胺(Polyethyleneim-ine,PEI)[26]、壳聚糖(Chitosan,CHI)[27]、溴棕三甲铵(Cetyltrimethylammoniumbromide,CTAB)[28−32]、聚乙二醇-聚赖氨酸[33],能够改变颗粒的表面电势,能够提高颗粒的转化率。1.6pH对颗粒的影响质粒DNA的结构受PLGA降解的酸性微环境影响。质粒DNA结构的改变与其释放的时间点相关,大量的超螺旋质粒DNA在最初的突释期间释放[34],缺口DNA和超螺旋质粒DNA在随后释放,这可能与质粒DNA置于PLGA颗粒的酸性微环境有关[35]。在制备过程中,PLGA会降低液相溶液的pH值。低pH环境通过改变单链和双链DNA的平衡导致质粒DNA的降解[36],当pH值小于或等于3时,就会大大影响转化效率[37]。低pH还会引起脱嘌呤作用。添加NaHCO3能够起到缓冲作用,添加一些阳离子聚化物也能起到保护作用。2PLGA增强核酸递呈包裹有DNA的PLGA颗粒可以通过多种途径被摄取,如口腔、鼻腔、雾化后肺吸入、肌肉注射、