汉恒生物-慢病毒生产及使用操作手册第二版

慢病毒载体构建及包装操作手册公司地址：上海市徐汇区斜土路1175号15楼E-mail:[e-mail]：021-51296258实验室地址：上海市张江高科技园区蔡伦路720弄张江药谷孵化器1号楼3141慢病毒生产及使用操作手册一、实验流程制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，三种质粒载体分别进行高纯度无内毒素抽提，共转染293T细胞，转染后6h更换为完全培养基，培养48和72h后，分别收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，病毒上清液通过超离心浓缩病毒。二、实验材料（一）慢病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为三质粒系统，组成为pspax2,pMD2G,pHBLVTM系列质粒。1、载体信息1)慢病毒克隆载体图谱如下：各载体用途如下表：慢病毒载体构建及包装操作手册公司地址：上海市徐汇区斜土路1175号15楼E-mail:[e-mail]：021-51296258实验室地址：上海市张江高科技园区蔡伦路720弄张江药谷孵化器1号楼3142用途慢病毒载体过表达pHBLV-CMVIE-IRES-ZsGreen、pHBLVCMVIE-Puro干扰pHBLV-U6-ZsGreen、pHBLV-U6-puro其他载体还有其他荧光标记和启动子混搭载体，以及tet-on系统高表达/干扰系列载体，详情可咨询公司分子生物学技术工程师。2）包装质粒信息如下：PSPAX2及PMD2G载体图谱和序列信息(购自addgene)2、细胞株293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养基为DMEM(含10%FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。三、包装细胞293T细胞的培养慢病毒载体构建及包装操作手册公司地址：上海市徐汇区斜土路1175号15楼E-mail:[e-mail]：021-51296258实验室地址：上海市张江高科技园区蔡伦路720弄张江药谷孵化器1号楼3143（一）293T细胞的冻存随着传代的次数增加，293T细胞会出现生长状态下降、突变等。为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。在细胞对数生长期进行冻存，增加细胞复苏成活率。1、去掉上清液，加入PBS洗去残留的培养基；2、加入0.25%的胰酶，消化1~2min后，镜下观察细胞变圆，细胞间间隙加大时，去除胰酶，加入新鲜培养基吹打混刀，移入离心管中。3、细胞计数，将细胞全部晃下，加入3mL37℃预热的10％DMEM，用10mL移液管进行吹打，较大力吹打6-8次即可，不留死角，之后，将所有细胞吸出，置于15mL离心管中，取50ul混刀后的细胞于1.5mLeppendorf管中，加入450ul10％DMEM，即为10倍稀释，混刀，取10ul细胞于计数板中计数。计数板上共4大格，每大格16小格。计数时，4大格均计数，总数除以4（得每大格细胞数），再乘以10（10倍稀释），即为实际n万/mL细胞浓度。4、细胞离心，1000rpm，5min。去掉上清。5、根据细胞计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基+20%FBS+10%DMSO）,重悬细胞，密度为3x106个/ml。6、分装进细胞冻存管，放入冻存盒中，放入-80℃超低温冰箱。7、第二天将细胞放于液氮罐中长久保存，并作记录。保存过程中，要不时复苏细胞检测细胞存活率，观察细胞状态等。（二）293T细胞的传代当细胞生长到汇合率达到80%~90%时需要对细胞进行传代操作，以扩大细胞数量，维持细胞良好的生长状态。1、消化细胞，方法同细胞冻存。2、细胞离心结束后，加入完全培养基重悬。3、根据具体情况，将细胞分到10cm培养皿中，每个培养皿补足到10ml培养基。慢病毒载体构建及包装操作手册公司地址：上海市徐汇区斜土路1175号15楼E-mail:[e-mail]：021-51296258实验室地址：上海市张江高科技园区蔡伦路720弄张江药谷孵化器1号楼31444、将培养皿平稳放回37℃、5%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。（三）293T细胞的复苏当细胞传代次数过多，细胞状态变差时，或者细胞出现污染事故时，需要丢弃并对昀初冻存的细胞进行复苏。1、设置温度为37~42℃的水浴。2、查看细胞库记录，根据记录从液氮罐中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，尽量在1~2min内使细胞溶液完全溶解。3、将细胞溶液转移到15ml离心管中，并在其中加上1ml新鲜的完全培养基，混刀后离心，1000rpm，5min。4、去掉上清，加入5ml新鲜的完全培养基，混刀沉淀后，转入6cm培养皿。5、将培养皿平稳放入37℃、5%CO2和95%相对湿度的培养箱中培养。6、第二天观察细胞存活率。给细胞换一下培养基。以后每天观察细胞生长情况。四、慢病毒包装和浓缩（一）质粒扩增构建好的慢病毒载体和辅助质粒需经过大量抽提，浓度大于1ug/ul,A260/280在1.7-1.8间方可用以包毒。推荐使用Qiagen大抽试剂盒进行质粒的大量去内毒素抽提。（二）传293T细胞将培养293T细胞T75瓶中的培养基吸净，加入2mL4度冰箱取出的0.25%胰酶，使其均匀覆盖瓶底，置于37度培养箱中3-5min，取出，摇晃可发现细胞于底部脱离，将其全部晃下，加入3mL37度水浴中预热的10％DMEM，移液枪用10mL移液管进行吹打，较大力吹打6-8次即可，不留死角，瓶口处较难吹打可将移液管对准培口，小力将培养基打出即可覆盖到接近瓶口的细胞。之后，将所有细胞吸出，置于15mL离心管中，取50ul混匀后的细胞于1.5mLeppendorf慢病毒载体构建及包装操作手册公司地址：上海市徐汇区斜土路1175号15楼E-mail:[e-mail]：021-51296258实验室地址：上海市张江高科技园区蔡伦路720弄张江药谷孵化器1号楼3145管中，加入450ul10％DMEM，即为10倍稀释，混匀，取10ul细胞于计数板中计数。计数板上共4大格，每大格16小格。计数时，4大格均计数，总数除以4（得每大格细胞数），再乘以10（10倍稀释），即为实际n万/mL细胞浓度。传代当天记为第一天，若第二天进行转染，铺900-1000万/T75；若第三天转染，铺350-400万/T75。每瓶T75加10mL10％DMEM培养基。转染当天观察细胞密度，80-90％满即可进行转染。转染前无需换培养基。（三）做脂转complexOptiMEM需在37度水浴中预热，LipofiterTM转染试剂需恢复至室温方可使用，使用前需摇匀。转染每瓶T75的complex成分如下：pspax10μgPMD2G10μgpHBLVTM系列载体10μg转染后6h换新鲜培液。注：LipofiterTM转染试剂为汉恒生物产品，使用说明参考LipofiterTM说明书。（四）病毒收集转染后48和72h分别两次收集病毒上清(24h收集后置换新鲜培液)，收集后以0.45μm滤器过滤,于40mL超速离心管中，4℃，72000g/min离心120分钟；（五）病毒重悬和保存500ul新鲜培养液重悬病毒沉淀，置于-80度甚至液氮保存。五、感染目的细胞（一）细胞准备将状态良好的目的细胞接种到24孔板，使细胞浓度为1×105/ml细胞，接种细胞数量因细胞的生长速度而略有不同，一般是保证第二天进行病毒感染的时候细胞汇合率介于50%至70%直接。（二）病毒感染慢病毒载体构建及包装操作手册公司地址：上海市徐汇区斜土路1175号15楼E-mail:[e-mail]：021-51296258实验室地址：上海市张江高科技园区蔡伦路720弄张江药谷孵化器1号楼31461.polybrene的选择：Polybrene:是带正电的小分子，与细胞表面的阴离子结合，提高慢病毒对细胞的感染效率，通常加入polybrene能提高感染效率2～10倍。Polybrene有一定的细胞毒性，有的细胞对polybrene的毒理反应明显，因此细胞感染时是否适合polybrene需要摸索；不同细胞对polybrene的敏感度不同，可以用1～10μg/ml的范围筛选合适的浓度，以24h内细胞无明显毒性反应为佳，可参考文献并进行预实验摸索，polybrene最常用的工作浓度为6～8μg/ml。注：1）汉恒生物的自产的Polybrene产品，用户可用以进行辅助感染。提供的Polybrene母液保存在-20℃（可保存1年以上），避免反复冻融3次以上，否则活性受影响。4℃可保存2周。2）Polybrene预实验请先以对照病毒进行摸索，部分细胞系MOI及Polybrene的使用参见附表2。2.感染细胞最佳MOI的测定MOI（MultiplicityofInfection，感染复数）是指每个细胞感染的病毒数，通常MOI越高，病毒整合到染色体的数量以及目的蛋白的表达量越高。对于分裂活跃的细胞，比如Hela、293细胞，MOI=1～3时，80%以上的细胞均表达目的基因。而对于非分裂细胞，比如原代细胞，感染效率较低。需要进行MOI梯度摸索实验，选择适合的MOI进行实验。3.感染步骤按实验需要将细胞铺板（比如12孔板）。细胞数以第2天密度约50%为宜。37℃培养过夜。对于Polybrene可施加的细胞：准备完全培养基和Polybrene混合物，Polybrene终浓度为摸索得到的最适终浓度。移去培养基并添加0.5mlPolybrene/培养基混合物于每孔中（适用于24孔板，其他孔板请相应调整体慢病毒载体构建及包装操作手册公司地址：上海市徐汇区斜土路1175号15楼E-mail:[e-mail]：021-51296258实验室地址：上海市张江高科技园区蔡伦路720弄张江药谷孵化器1号楼3147积。）对于不适用Polybrene的细胞，以上步骤省略，直接进入下面步骤。感染前，从冰箱取出并在37℃水浴中快速融化病毒，吸去细胞原有培养基，将病毒原液加入细胞中，轻轻8字混匀。（具体加入的病毒数可参考附表1）感染后第二天（约12小时），吸去含病毒的培养液，换上新鲜的完全培养液，继续37℃培养。感染后48小时，对于带GFP报告基因的病毒，可通过荧光显微镜观测GFP表达效率，对于携带Puromycin抗性基因的病毒，换上含适当浓度的Puromycin的新鲜完全培养液，筛选稳定转导的细胞株（详见下方）。注意：溶化的shRNA慢病毒颗粒置于冰上。反复冻溶或长时间将病毒颗粒暴露于常温可使病毒效价降低。4.Puromycin抗性筛选：Puromycin标准的施加终浓度范围为1～10μg/ml，不同细胞puromycin的工作浓度不同，请查找相关文献（部分细胞参考用量见下图），另外请设不感染筛选对照（未经过病毒感染的野生型细胞），加入等量等浓度的puromycin。慢病毒载体构建及包装操作手册公司地址：上海市徐汇区斜土路1175号15楼E-mail:[e-mail]：021-51296258实验室地址：上海市张江高科技园区蔡伦路720弄张江药谷孵化器1号楼3148部分细胞puromycin参考值CelllineSpeciesPuromycin(µg/ml)293Human3HeLaHuman3B16Mouse1-3PC1.0Hamster10MC3T3-E1Mouse10H9C2Rat1MCF-7Human1-3MDA-MB-×××Human1-3HepG