第六章植物细胞培养

第六章植物细胞培养喀什大学生地学院方志刚2019.4目的与要求掌握单细胞培养概念，了解单细胞制备途径，掌握单细胞培养繁殖的方法。掌握植物细胞悬浮培养的意义和细胞株筛选方法，了解悬浮培养类型及方法，清楚细胞悬浮培养的应用。具有单细胞分离和培养基本能力，具备细胞悬浮成批培养和连续培养基础知识。植物细胞培养植物细胞培养（plantcellculture）：指对植物器官或愈伤组织上（离体条件下）分离出来的单细胞(或小细胞团)进行培养，形成单细胞无性系或再生植物的技术。优点：操作简便、重复性好、群体大等。分类：1.根据规模：小规模培养、大批量培养2.根据培养方式：悬浮培养、平板培养、看护培养、纸桥培养法3.根据要求的产物：诱变的细胞培养、生产次生产物的细胞培养目前，植物细胞培养被广泛应用于突变体筛选、遗传转化、次生代谢产物的生产等诸多方面。植物细胞培养的意义：（1）研究细胞生理代谢过程及各种影响因子；（2）用于植物品种的改良（细胞株遗传转化）；（3）用于植物次生代谢物质的生产。单细胞培养细胞的悬浮培养一、单细胞培养（通常以叶片为材料）（一）单细胞的分离分离方法：机械法（薄壁细胞组织排列松散，细胞间接触少）和酶解法（利用专一性水解酶降解细胞间中胶层）。各有优缺点。由完整的植物器官分离单细胞机械法Ball&Joshi(1965)Noggle(1967)Joshi&Ball(1968)研究者和时间：研究材料：花生成熟叶片第一种方法：用刀片刮叶片只有薄壁组织排列松散，细胞间结触点很少时用机械法分离叶肉细胞才能取得成功。机械法的优缺点：•优点：完整细胞不受酶的伤害，无需胞质分离，对于生理生化研究较为理想•缺点：细胞产量低，不易获得大量活性细胞；仅适用于只有薄壁组织排列松散，细胞间结触点很少的叶片类型添加0.8%甘露醇及1%硫酸葡聚糖钾酶解法的优缺点：•优点：可以得到高纯度的叶肉细胞；产量高；细胞不易破•缺点：细胞受到酶伤害；细胞受到质壁分离影响；对于，大麦、小麦和玉米很难通过酶解法使细胞分离（叶肉细胞伸长，并在许多地方收缩，细胞间形成一种互锁结构）机械法和酶解法比较机械法酶解法1.细胞不受到酶的伤害；2.不用质壁分离；3.细胞产量低；4.细胞易破。1.细胞受到酶的伤害；2.要质壁分离；3.细胞产量高；4.细胞不易破。由培养组织（愈伤组织）分离单细胞材料：胡萝卜肉质根步骤：1诱导产生愈伤组织2愈伤组织反复继代，使组织不断增殖，提高愈伤组织的松散性；由愈伤组织分离单细胞的方法：1、将未分化、易散碎的愈伤组织转到有液体培养基的三角瓶中进行振荡培养，获得悬浮细胞液。2、用孔径为200um的无菌网过滤，4000RPM/M离心，除去比单细胞小的碎片，获得纯净的细胞悬浮液。3、用60-100UM的网过滤，再用20-30UM的网过滤，离心除去细胞碎片。4、回收获得的单细胞，并用液体培养基洗衣净，可用于培养。方法简便、易于获得大量高质量的单细胞，应用广泛单倍体的应用价值：1、在植物育种中使后代迅速纯合、提高选择效率3、排除杂种优势对后代的影响、4、遗传研究的良好实验材料体系，消除致死原因5、突变体的筛选，选育新型自交系6、遗传转化的受体材料，基因表达研究的良好材料（二）单细胞培养对分离得到的单个细胞进行培养，诱导其分裂增殖，形成细胞团，再通过细胞分化形成芽、根等器官或胚状体，直到长成完整植株的技术。培养方法：平板培养（浅层液体培养和固体平板培养）、看护培养、微室培养、条件培养基培养法。（1）平板培养法：分散的植物细胞接种于含薄层固体培养基的培养皿内的培养过程称为平板培养法。方法是将经机械破碎过筛或酶(纤维素酶及果胶酶等)消化分散纯化的细胞，经计数及稀释，接种到加热熔化而刚冷却至35℃左右的固体培养基中充分混匀，倾入培养皿中，石蜡密封，于25℃培养，约20天后细胞即可生长成团。统计生长情况。（2）看护培养法：从悬浮培养物或脆弱愈伤组织上用针或玻璃毛细管分离单细胞，每个细胞放在一个方形滤纸片的上表面，而滤纸片放在活跃生长的愈伤组织上进行培养的方法。（3）微室培养法：悬浮单细胞接种于凹玻片或玻璃环与盖玻片组成的微室内的固体培养基中的培养方法。（4）条件培养基培养：条件培养基是在培养基中加入高密度的细胞进行培养。一定时间后这些细胞就会向培养基中分泌一些物质，使培养基条件化。这样的培养被利用来进行某些单细胞的培养的方法。条件培养基的准备：将液体培养中培养了4~6周的高密度细胞滤掉，将该培养基制成液体培养基或固体培养基用来培养单细胞或低密度细胞群体，可明显提高单细胞培养物存活和分裂能力。第二节细胞悬浮培养细胞的悬浮培养(cellsuspensionculture)是指将游离的植物细胞按一定的细胞密度，悬浮在液体培养基中进行培养的方法。适宜于大规模培养，细胞工程产业的技术基础。为研究细胞的生长和分化提供了一个独特的实验系统。1、愈伤组织诱导材料自来水冲洗——75%的乙醇擦洗——将材料切成小块（带形成层）——接种到MS+2,4-D2mg/L+CH500mg/L+琼脂0.8%,pH5.8的培养基上——得愈伤组织——扩大繁殖。2、单细胞悬浮液的制备愈伤组织转移到液体培养基中——4r/min转床培养10d——140m×140m的细胞筛过筛——使细胞密度达到10个/ml左右——得单细胞悬浮液。一、前期准备在细胞悬浮培养中，采用生长快、有效成分高、适合悬浮培养的细胞株。筛选细胞株的方法是：（1）从培养的愈伤组织中挑选出外观疏松、生长快的浅色愈伤组织。（2）用振荡或酶法，游离出单个细胞或小细胞团。（3）接种在固体培养基上培养2周。（4）挑选生长快的细胞株并继代培养。（5）取各细胞系的培养物，进行有效成分的测定，筛选出有效成分高而生长较快的细胞株。二、培养类型和方法（一）成批培养指把细胞分装在一定容积的培养基中进行培养，当培养物增殖到一定量时，转接继代，建立起单细胞培养物。它是进行细胞生长和细胞分裂的生理生化研究常用的培养方法。（1）细胞生长在固定体积的培养基上，直至培养基中的养分为细胞耗尽为止。（2）用适当搅拌的方法增加和维持游离细胞和细胞团在培养基中的均匀分布。（3）在整个培养过程中，细胞数目会不断发生变化，呈现出明显的慢-快-慢，最后增长停止的细胞生长周期。（4）成批培养结束后，若要进行下一批培养，必须另外进行继代培养，其方法是用注射器吸取一定量的含单细胞和小细胞团的悬浮培养物，并移到含有新鲜培养基的培养瓶里，继续进行培养。1、成批培养法细胞生长周期延滞期对数增长期直线生长期缓慢期静止期时间细胞数目（二）半连续培养指每隔一定时间后倒出一半的悬浮液，并同时补充加入等量新鲜培养液。能重复地取得大量、均一的培养细胞，供生物研究之用。是利用特制的培养容器进行大规模细胞培养的一种方式。在培养过程中，以不断抽取悬浮培养物并注入等量新鲜培养基，使培养物不断得到养分补充，保持其恒定体积的培养。（三）连续培养1、连续培养的特点（1）由于不断加入新鲜培养基，保证了养分的充分供应，不会出现悬浮培养物发生营养不足的现象。（2）可在培养期间使细胞保持在对数生长期中。细胞增殖速度快。（3）适于大规模工业化生产。2、连续培养的种类封闭式连续培养：系统中的细胞数目不断增加。开放式连续培养：系统中的细胞密度保持恒定。封闭型连续培养：在培养过程中，排除的旧培养基由加入的新鲜培养基进行补充，进出数量保持平衡，从而使培养系统中营养物质的含量总是超过细胞生长的需要。悬浮在排除液中的细胞经机械方法收集后再放回培养系统中，因此在这样培养方式中，随着培养时间延长，细胞密度不断增加。开放型连续培养：为了不使限制细胞生长的因子出现，创造一个稳定的细胞生长的环境，必须建立一套自动控制系统来调节培养基注入的数量和培养液的总体积。在开放连续培养中，注入的新鲜培养液的容积与流出的培养液容积相等，其中细胞的密度也保持恒定，并通过调节流入和流出的速度，使细胞的生长速度一直保持在一个稳定状态，流出的细胞相当于培养系统中新细胞的增加数。3、为了保持在开放连续培养中细胞增殖的稳定性，采取的控制方法：（1）浊度恒定法（2）化学恒定法三、悬浮细胞的继代在悬浮培养中，为了保持一定的悬浮细胞增殖速度和增殖量，应定期做继代培养，最适的周期一般为1-2周。但实际所需的时间和接种量应视不同细胞系而定。继代时间为1周的细胞系可用1：4的接种量，继代时间为2周的可用1：10的接种量。在悬浮培养中，细胞刚进入静止期之初，细胞悬浮液达到最大量，就必须进行继代培养。因为处在静止期的细胞悬浮液保存时间太长会引起细胞的大量死亡和解体。为了加速细胞增殖，有的甚至在对数生长期末就进行继代。四、培养细胞的同步化同步培养：在培养基中大多数细胞都能同时通过细胞周期的各个阶段，同步性的程度以百分百分数表示。实现悬浮培养细胞同步化的方法：1、饥饿法：先对细胞断绝供应一种进行细胞分裂所必需的营养成分或激素，使细胞停滞在G1期或G2期，经过一段时间的饥饿后，当重新在培养基中加入这种限制因子时，静止细胞就会同时进入分裂。2、抑制法：使用DNA合成抑制剂，也可使细胞培养同步化。当细胞受到这些化学药物处理后，由于这些核苷酸类似物的存在阻止了DNA的合成，细胞周期只能进行到G1期，细胞都滞留在G1期和S期的边界，当把这些抑制剂除去后，细胞就进入同步分裂。1、培养基成分：N6，MS，B5适合单子叶植物细胞，MS，B5，LS，SL适合双子叶植物细胞。条件培养基适合单细胞和低密度细胞培养。需要硝态氮、铵态氮、无机磷浓度更高。六、影响细胞培养的因素2、细胞密度：培养基的成分和起始细胞密度对单细胞培养成败有影响。起始密度：细胞培养最低的有效密度，即能使细胞分裂、增殖的最低接种量，低于这个密度细胞不能分裂，甚至很快解体死亡。3、植物生长调节剂：细胞悬浮培养时，常表现一种自然的聚集现象，加入2，4-D，少量水解酶或酵母提取液，能够增加细胞的分散度。4、pH和二氧化碳浓度在悬浮培养时，PH变动相当大。加入EDTA使铁和其他金属离子长期处于可利用状态。硝态氮和铵态氮之间进行调整可作为稳定PH的一种方法。二氧化碳对细胞培养没有太大影响，但在低密度细胞培养中，二氧化碳对于诱导细胞分裂可能有重要作用。第三节植物细胞生长和活力的测定一、悬浮培养中细胞生长的测定1、细胞计数：把1份培养物加入到2份8%三氯化铬溶液中，在70℃下加热2-15分钟，然后将混合物冷却，用力震荡10分钟，用血球计数板进行细胞计数。2、细胞总体积：将已知体积的均匀分散的悬浮液放入1个15ml刻度离心管中，在2000g下离心5min，得到细胞沉积的体积。细胞密实体积（PCV）：以每ml培养液中细胞总体积的ml数表示。3、细胞鲜重和干重：4、细胞有丝分裂的指数：在一个细胞群体中，处于有丝分裂的细胞占细胞总数的百分数。5、细胞植板率=每个平板形成的细胞团数/每个平板接种的细胞总数二、培养细胞活力的测定1、TTC法2、荧光素二乙酸法（FDA法）3、伊凡蓝染色法