紫外分光光度法测定土壤过氧化氢酶活性

收稿日期：2009-07-30；修订日期：2009-09-26基金项目：生物资源保护与利用湖北省重点试验(湖北民族学院)开放基金项目；湖北省教育厅重点项目(D20081010)作者简介：杨兰芳(1964-)，男，博士，副教授，湖北来凤人，研究方向：土壤物质循环及其环境效应。Tel:[phone]，E-mail:[e-mail]紫外分光光度法测定土壤过氧化氢酶活性杨兰芳1，曾巧1,2，李海波1，闫静静1（1.湖北大学资源环境学院，湖北武汉430062；2.中国科学院寒区旱区环境与工程研究所，甘肃兰州730000）摘要：土壤过氧化氢酶是土壤中非常重要酶类，为了探索一种测定土壤过氧化氢酶活性的简单、可靠而适用的测定方法，我们进行了利用紫外分光光度法测定土壤过氧化氢酶活性的方法研究。结果表明，紫外分光光度法重现性优于高锰酸钾容量法，溶液在240nm处的吸光度可以稳定11小时以上，对4种土壤分析表明，紫外分光光度法的测定结果与高锰酸钾容量法之间无显著差异。传统高锰酸钾容量法加酸后再过滤容易导致溶液有颜色，过滤液易浑浊，过滤时间长。本试验表明，在过滤前加入饱和铝钾矾，然后直接将溶液过滤到盛有酸的容器内，既可以使溶液无色，又能使溶液澄清透明，还能使过滤速度大为加快。总之紫外分光光度法重现性好、稳定时间长，操作简单，不需要特殊试剂，避免了容量法的滴定误差，是一种值得推广普及的测定土壤过氧化氢酶活性的好方法。关键词：紫外分光光度法；土壤；过氧化氢酶；容量法中图分类号：S151.9文献标识码：A文章编号：0564-3945（2011）01-0207-04土壤通报ChineseJournalofSoilScienceVol.42,No.1Feb.,2011第42卷第1期2011年2月土壤酶活性是土壤生物活性和土壤生化反应强度反映[1]，也是土壤肥力水平的反映，土壤中的生化反应过程和养分形态的转化一般都是在土壤酶的参与下进行的。土壤酶主要来源于土壤微生物的活动和植物分泌物，土肥力水平[2]、土壤污染状况[3,4]以及土壤对环境变化的响应[5]都会影响土壤酶活性。通过分析土壤酶活性可以评价土壤土壤微生物活性、生物化学反应程度、土壤肥力水平和土壤污染状况。过氧化氢酶是生物呼吸、生物代谢过程，以及土壤动物、植物根系分泌及残体分解[6,7]中的重要酶类，在生物体(包括土壤)中，过氧化氢酶的作用在于破坏对生物体有毒的过氧化氢[8]。因此无论研究土壤、植物，还是动物过氧化氢酶都具有重要意义。一种快速、简便、准确测定过氧化氢酶活性的方法无疑对过氧化氢酶的研究具有促进作用。测定土壤过氧化氢酶活性主要是基于测定过氧化氢与酶作用后释放出的氧和测定剩余的过氧化氢两方面。利用紫外分光光度法直接测定土壤过氧化氢酶活性的方法目前尚未见报道。本试验探索一种利用紫外分光光度法直接测定土壤过氧化氢酶活性的方法，本方法的成功将有助于土壤过氧化氢酶分析和研究。1材料与方法1.1土壤材料试验所用土壤材料为红壤1、红壤2、山地黄壤和山地暗黄棕壤。红壤1和红壤2采自武汉市鲁磨路南望山山脚的荒芜耕地，山地黄壤采自庐山三宝树附近，山地暗黄棕壤采自庐山博物馆旁边。土壤采回后在实验室内挑出根系等植物残体和岩石碎块，自然风干后过1mm筛备用。所用土壤之基本理化性质如表1。1.2所用试剂与仪器（1）0.3%的H2O2：取30%的H2O2试剂稀释100倍即可，溶液准确浓度用高锰酸钾标定。（2）1.5molL-1硫酸：取42ml浓硫酸，稀释后定容至500ml。（3）饱和铝钾矾：铝钾矾即明矾(KAl(SO4)2·12H2O)在20℃溶解度为10.84g，30℃的溶解度为15.41g.（4）0.01蚪虔molL-1高锰酸钾：称取3.16g高锰酸钾(KMnO4)溶解后定容至1L，其准确浓度用标准草酸钠标定。（5）紫外分光光度计：UV-9100，北京瑞利分析仪器有限公司。（6）震荡器：ZD-8801回转振荡器，上海康华生化仪器制造厂。土壤Soil红壤1红壤2黄壤黄棕壤有机质Organicmatter(gkg-1)13.5016.1424.15110.97碱解氮AvailableN(mgkg-1)83.7598.14169.10487.65有效磷AvailableP(mgkg-1)11.945.460.502.53pＨ5.585.764.474.20CEC(Cmol(+)kg-1)12.3410.7315.7227.42表1供试土壤基本理化性质Table1Thebasicsoilpropertyinexperiment第42卷土壤通报1.3方法1.3.1紫外分光光度法测定土壤过氧化氢酶活性（1）测定原理过氧化氢酶能酶促过氧化氢分解生成水和氧气。通过加入定量过量的过氧化氢，与土壤作用一段时间后，加入量与剩余量之差即为被酶催化反应消耗的过氧化氢，以此表示酶活性。过氧化氢（H2O2）在240nm处有强烈吸收，通过测定与土壤反应后溶液在此波长下的吸光度，即可得到溶液中过氧化氢的浓度，从而可计算酶的活性。（2）测定步骤称取土样2.00g于三角瓶，加入40ml蒸馏水，加入5ml0.3%的H2O2溶液，在震荡机上震荡20分钟。取下后迅速加入饱和铝钾矾1ml，立即过滤于盛有5ml1.5molL-1的硫酸溶液的三角瓶中。滤干后，将滤液直接在240nm处用1cm石英比色皿测定吸光度As。同时做无土A0和无基质Ak对照。1.3.2高锰酸钾滴定法测定土壤过氧化氢酶活性称取土壤2.00g于100ml三角瓶中，加入40ml蒸馏水，加5ml0.3%的H2O2溶液，振荡20分钟后加入1ml饱和铝钾矾，立即过滤于盛有5ml1.5M硫酸的三角瓶中，滤干后，吸取滤液25ml，用0.01蚪虔molL-1的高锰酸钾溶液滴定至紫色，同时做无土对照。1.3.3计算及数据处理为了便于紫外分光光度法与高锰酸钾容量法的结果相比较，都统一用每20分钟内每克土壤分解的过氧化氢的毫克数表示酶活性。（1）紫外分光光度法酶活性的计算E=Ae×TW，Ae=A0-As+Ak，T=CVA0×51V0×17。E是土壤过氧化氢酶活性，W为土样重量，T是单位吸光度相当于过氧化氢的毫克数，A0是无土对照即空白溶液的吸光度，As是样品溶液的吸光度，Ak是无基质对照溶液的吸光度，C是高锰酸钾的浓度，V是吸取V0ml的无土对照即空白溶液用高锰酸钾滴定所消耗的高锰酸钾溶液的体积。（2）高锰酸钾容量法酶活性的计算：E=(V-Vs)C×51V0×17W。V是V0体积空白溶液所消耗的高锰酸钾体积，Vs是V0体积样品溶液所消耗的高锰酸钾体积，C是高锰酸钾的浓度，W是土壤重量。1.3.4土壤基本理化性质测定土壤基本理化性质用常规法，即有机质用硫酸重铬酸钾外加热容量法，碱解氮用碱解扩散法，速效磷用钼锑抗显色分光光度法，土壤pH用电位法(水土比2.5∶1)，阳离子交换量(CEC)用醋酸铵法[9]。2结果分析2.1方法的重现性用红壤1做样品，称取20份土样，每份2.00g，其中10份用作加基质的反应，10分用作无基质对照，同时做一份空白对照即无土对照。按测定方法处理测定溶液吸光度后，吸取25ml用高锰酸钾溶滴定，分别计算两种方法的酶活性。由表2可见，紫外分光光度法测定的土壤过氧化氢酶活性与高锰酸钾容量法测定土壤过氧化氢酶活性的平均值非常接近，t检验表明，两种方法测定结果之间无显著差异（P=0.663）。10次重复的重现性来看，高锰酸钾容量法的标准差和变异系数大于紫外分光光度法。说明紫外分光光度法的重现性优于高锰酸钾容量法。2.2稳定性将红壤1称取10份，每份2.00g，其中5份加过氧化氢，5份不加过氧化氢用作无基质对照。按操作步骤测定吸光度，然后分别在放置2、3、4、11小时后测定吸光度。表3可见，放置时间对吸光度影响很小，无论是有基质的样品，还是无基质的对照，各放置时间之间无显著差异，说明在酸性条件下，过氧化氢很稳定，放置11h后吸光度无显著变化。2.3硫酸加入方式的影响用红壤2称取20份，每份2.00g，进行4种处理，每处理重复5次，即加过氧化氢振荡后加酸5ml立即过滤、加过氧化氢振荡后直接过滤到盛有5ml硫酸的三角瓶中、无基质对照加酸后过滤和无基质对照直接过滤到盛有5ml酸的三角瓶中。表4表明，硫酸加入顺序对溶液吸光度有显著影响。在加酸后过滤的条件方法Method紫外光度法钾容量法重复次数Thenumberofrepeat1010酶活性均值Meanofenzymeactivity5.195.36标准差Standarderror0.200.27变异系数CV3.855.04表2两种方法测定的红壤过氧化氢酶活性(mgH2O2g-1)Table2Catalaseactivityinredsoilmeasuredbytwomethods处理Treatment有基质无基质00.672±0.0030.104±0.00520.672±0.0040.103±0.00330.666±0.0060.101±0.00540.669±0.0070.104±0.004110.676±0.0060.108±0.005放置时间Time表3不同放置时间(h)下的吸光度Table3Theabsorbencyinvariousplacingtime2081期下，加过氧化氢样品的吸光度已经超出了仪器的读数范围，无法测得吸光度，无基质对照的吸光度也在1以上，这就不能测得土壤过氧化氢酶的活性。这种方法得到的溶液有颜色，即使用容量法测定也影响终点判定，在有机质含量高的条件根本就无法滴定。在直接过滤到盛有酸的三角瓶中的条件下，不管是加过氧化氢的样品，还是无基质对照，其吸光度均在正常范围，由此得出的土壤过氧化氢酶活性与用高锰酸钾容量法测得的酶活性之间无显著差异。2.4铝钾矾的影响取红壤2称取30份，每份2.00g。设置6个处理，即加过氧化氢的样品和不加过氧化氢的无基质对照。按振荡前加、振荡后加1ml饱和铝钾矾和不加铝钾矾，每处理重复5次。表5可见，铝钾矾的加入与否以及加入方式对溶液吸光度有显著影响。无论是有基质的样品还是无基质对照，不加铝钾矾时，过滤速度慢，且溶液浑浊，所以不加铝钾矾的溶液吸光度显著高于加铝钾矾的吸光度。铝钾矾的加入顺序对有基质样品的吸光度有显著影响，振荡前加铝钾矾的吸光度大于振荡后加铝钾矾的吸光度。无基质对照的吸光度不受铝钾矾加入顺序的影响，振荡前加和振荡后加二者的吸光度无显著差异。2.5不同土壤上的运用取红壤1、红壤2、山地黄壤和山地暗黄棕壤分别运用紫外分光光度法和高锰酸钾容量法测定过氧化氢酶活性，每种土壤均重复5次，结果见表6。由表6可见，4种土壤的过氧化氢酶活性的紫外分光光度法测定结果与高锰酸钾容量法测定结果之间无显著差异，说明紫外分光光度法可以运用于土壤过氧化氢酶活性的测定。3讨论土壤过氧化氢酶的测定方法主要有高锰酸钾容量法[10~12]、气量法[11,13]、纸片法[11]、气相色谱法[14,15]等。高锰酸钾容量法虽然简单，但是滴定过程人为误差大，操作比较费时。气量法需要特殊装置，操作麻烦，不便于批量样品分析，纸片只能做为定性，定量误差太大，而气相色谱法需要特殊的仪器，仪器设备昂贵，操作调试复杂，不利于普及。Trasar-Cepeda等[16]提出了一种可见分光光度法，其原理是基于土壤与定量的过氧化氢作用一定时间后，剩余的过氧化氢在过氧化物酶作用下产生氧气，可以氧化4-氨基安替比邻与苯酚形成一种有色物质在505nm处有强吸收，但是该法操作也比较繁琐，同时需要过氧化物酶，不仅不好购买，其价格也不便宜，分析成本高。探索一种简单适合于批量分析而又便于普及的方法对于土壤过氧化氢酶的研究具有重要实践价值。本试验证明，利用紫外分光光度法测定土壤过氧化氢酶活性具有重现性好、稳定、操作简单、适宜于批量分析、仪器设备不昂贵等多方面优点，是一种值得推广普及的方法。本试验发现，利用紫外分光光度法测定土壤过氧化氢酶活性中，必须在振荡后将溶液过滤到盛有硫酸的器皿中，而不能按传统容量法那样加酸后再过滤。因为加酸后