田洁--细胞力学加载装置实验报告

重庆大学研究生专业实验教学实验报告书重庆大学研究生院制实验课程名称：细胞力学加载实验技术实验指导教师：吕永钢学院：生物工程学院专业及类别：生物医学工程（学术）学号：20121902057姓名：田洁实验日期：2013.5.9成绩：一、实验目的⒈学习细胞力学加载的基本原理及相关知识细胞力学是现代生物力学近几年来发展十分迅速的一个前沿领域，也是组织工程学的一个重要组成部分。它涉及到细胞在载荷作用下细胞、细胞膜、细胞骨架的变形、弹性常数、粘弹性、粘附力等力学性能的研究，以及力学因素对细胞生长的影响。对于细胞力学来讲,其研究的关键则是取决于细胞的加载和实验技术。细胞力学是组织工程和细胞工程的基础之一，常常要研究机械力对细胞形态变化及生长的影响。由于体内环境异常复杂，细胞的体外分离和培养技术是研究细胞生理、病理现象的一种重要手段，也是生物力学中迅速发展起来的前沿领域和目前细胞力学研究的重要方法。近年来有关生物组织应力一生长关系的研究表明，从器官、组织到细胞、亚细胞等各个层次上的生命运动都是在一定力学环境中进行的。应力与生长的关系在细胞水平上主要体现在两个方面：单个细胞的生物学行为，如增殖形态变化和分泌功能等的响应；群体细胞组织化的整体行为响应，如血管内皮细胞收缩功能的增强、机械信号传导以及基因的表达等。机械力深刻影响着细胞组织的生长、维持和重建，是细胞工程及组织工程的一个重要因素。⒉熟悉Flexercell-4000操作流程和注意事项。本实验采用Flexercell-4000柔性基底拉伸加载系统,是由美国Flexcecrell公司生产用来对体外培养的组织或细胞施加拉伸的实验装置。加载实验过程在二氧化碳培养箱内进行，在此箱内，实验样本培养于特制的培养板上，可以接受不同波形、频率和时间的加载，加载程序由FX一4000计算机软件自动控制。Flexcell-4000细胞应力加载系统为二维细胞和三维细胞提供双轴向应力和单轴向应力。操作流程：1）、开启应力加载控制器、开启电脑2）、开启FlexSoftFX-4000软件，命名和设置参数3）、将培养有细胞的细胞培养板放在应力加载平台上，盖紧，关闭培养箱。4）、打开气体阀门装置。先开泵管，再开阀门5）、点击“start”，运行软件6）、运行软件过程中，若实时参数与预设参数有误差，点击“stop”，将培养箱中的细胞培养板和应力加载平台尽可能盖紧，再运行软件。7）、运行结束后，关闭气体阀门装置，先关闭阀门，再关闭泵管开关，关闭应力加载控制器，最后关闭电脑注意事项：1）、开启和关闭气体阀门装置时，注意顺序。防止装置损坏或发生意外2）、将细胞培养板和应力加载平台要尽量盖紧，不留缝隙，以减少误差二、实验仪器设备材料：前交叉韧带（ACL）细胞，塑胶手套，细胞培养瓶，细胞培养瓶，镊子，无菌吸管，废液缸，75％酒精棉球，酒精灯，Bioflex6孔培养板仪器：Flexercell-4000力学加载系统，倒置显微镜，超净工作台，CO2培养箱试剂：RPMI1640培养基，小牛血清，0.25％胰蛋白酶，PBS溶液FX一4000柔性基底拉伸系统的组成(l)FX一4000软件的计算机控制器(FlexCentral)(2)负压输出控制F(elLxink),真空源负压泵(3)真空基底板(BasePlate&Gasket),密封垫,加载平台(4)BioFlex培养板BioFlex培养板为一次性,六孔硅胶膜上均包被有不同的蛋白质或氨基酸如:胶原蛋白(eollagen),弹性蛋白(elastin),海带氨酸(lmainin)氨基(maino)等。可以使用Flexeerell如:肌肉、心肌、血管。拉伸加载系统进行实验的细胞或组织有很多，例皮肤、肌键、韧带、骨和骨等。三、实验原理简单介绍基底形变加载技术，需要特别说明Flexercell-4000的实验原理基底膜形变加载技术的基本原理是将所要研究的细胞培养在弹性膜（板）上，待其生长到一定程度后将机械拉伸力作用于弹性膜。由于细胞贴壁生长，因此应力通过拉伸弹性膜使其形变而传递给细胞，以达到研究目的。基底应变应力加载技术，通过梁在左右对称的四个支撑点间变形后梁表面积变化的原理，适用于针对体外培养的细胞进行力学加载的装置，采用微处理器控制定时、位移、频率、延时启动、手动调整、自动工作、显示等状态。驱动电路提供放大信号为数控步进电机提供各种电流及频率，并由数控步进电机执行微处理器命令运行各种运转速度、位移，产生拉伸或压缩应力，精确控制冲压头的位移量，冲压头作用于专用培养皿使贴壁生长于培养板上的细胞发生形变。利用橡胶密封垫在细胞培养板基底膜与基座之间形成封闭腔，利用封闭腔抽真空产生的负压使弹性基底膜发生形变，通过计算机控制系统调节气体的压力来改变基底膜的垂直形变量，从而控制细胞受力的大小，通过对硅胶膜片的应力分析，真空封闭腔内外气压差与基底膜变形后的径向长度的对应关系可通过编写设备的内部嵌入程序精确求得。真空泵抽吸弹性基底膜使之发生拉伸应变，圆形基底膜由于周边固定，其中心和外周部分所发生的变形不尽相同，中心大而外周小，因此细胞在弹性膜上受到的牵拉作用并不均匀。Flexercell-4000的实验原理：该系统用真空负压对生长中的细胞（组织）进行加载，加控制的静力或动力循环使膜变形，从而使贴在膜上生长的细胞（组织）也发生相应的变形，诱发细胞（组织）发生生物学变化，当只有BioFlex培养板时，基膜最大伸长可达到30%，有BioFlex培养板和加载平台时，基膜的伸长可过20%。设置的参数如下：1.培养板膜的最小和最大伸长率（0-30%）2.频率3.加载波形:静力加载、正弦波、心形波、三角波、方波和自定义波形四、实验内容1)、制定实验计划和操作程序。根据实验要求，准备各种所需器材和物品。在实验前3天左右将前交叉韧带（ACL）细胞接种于Bioflex6孔培养板上，在培养箱内培养60-72个小时，当ACL细胞达到70-80%融合时，吸取原配养基，加入3ml无血清培养基，之后的样品就可以直接用于实验。2)、开始试验前20-30分钟打开细胞室及实验操作台的紫外灯进行照射；进入细胞室前关闭紫外灯。3)、进入无菌培养室前用肥皂洗手，再用75％酒精清洗整个手掌4)、进入细胞间后更换紫外灭菌后的拖鞋和实验服。实验操作时配带口罩；换好衣服后用75％酒精消毒喷手消毒。5）、进入实验室后，打开电脑，之后打开电机泵，抽真空。直到在电脑显示屏上看到的信号比较稳定。6）、将1）中得到的样品培养箱内进行密封固定好后，对其进行12h的强度为sin12%，0.5HZ正弦波的力学刺激。7）、实验结束后，应先关仪器在关电脑。8）、将实验后的样本在倒置显微镜下进行拍照，保存照片并对其进行相应的分析。五、实验数据前交叉韧带细胞（ACL）加载前后的细胞图（如下）未加载12%静态加载6h后六、数据处理及结果分析实验结果：从上述二个图中看出细胞的形貌发生很大变化。经过12%静态加载后其单个细胞变得更加长、更扁；细胞外基质明显减少。结果分析：从上述图中分析，力学对细胞的影响是比较明显的，也说明了在体内血流的剪切力或者拉伸力会对细胞有很大的影响。所以在研究细胞在体内的行为时，要充分考虑力学环境对细胞的生物学行为。就如对ACL进行力学加载后，细胞的形态以及周围的胞外基质发生了很大的变化。机械力对细胞引起的各种作用，可以有局部效应和整体效应，前者指剪切力对新陈代谢产物或细胞器的作用，而后者则指细胞整体行为(如凋亡、增殖)的改变。而对细胞的改变包括：激活离子通道对细胞膜上蛋白分子的作用对内皮细胞ICAM一1表达的影响对细胞骨架的作用剪切力对单核细胞MCP-1的影响剪切力作用原癌基因c-fos和c-myc的表达由于生物医学的需要，细胞研究对象范围广泛，包括红细胞、白细胞、血小板、内皮细胞等。近年来在外部环境，主要是在力学血管血流形成等研究的影响下，对上述细胞各领域的影响进行了深入的研究。七、实验小结1、实验要注意无菌环境，进入实验室要戴口罩，穿灭了菌的衣服,以免带入细菌影响实验结果。避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污染机会。2、抽真空时，看到电脑显示屏上信号比较稳定后才进行后续实验。3、开启和关闭气体阀门装置时，注意顺序。防止装置损坏或发生意外。4、将细胞培养板和应力加载平台要尽量盖紧，不留缝隙，以减少误差。