原料药中杂质的控制与案例分析

原料药中杂质的控制与案例分析周立春2011.6.19主要内容杂质的定义与分类杂质的检测方法杂质检查方法的建立与验证杂质的定义及分类定义：任何影响药品纯度的物质。分类：一、按化学特性分类：有机杂质、无机杂质、有机挥发性物质。二、按来源分类：有关物质（反应前体、中间体、副产物、降解产物等）、其它杂质、外来物质。三、按结构分类：其他甾体、其他生物碱、几何异构体、光学异构体和聚合物。药典中的分类方式1有机物质有关物质－起始原料－中间体、副产物－降解产物－聚合物－异构体多晶型杂质残留溶剂3有机挥发性化合物2无机杂质－无机盐阴离子阳离子－重金属催化剂－过滤介质、活性炭杂质的检测方法物理常数测定法旋光度-检查具有光学活性的杂质(尼莫地平)紫外分光光度法杂质吸光度-在特定波长具有紫外吸收的杂质（葡萄糖）容量滴定法过氧化物（大豆油）、还原糖（乳酸）重量法酸中不溶物（磷酸氢钙）、可溶性物质（氧化锌）比色比浊法游离淀粉（氧化淀粉）、碘化物（甲状腺粉）、铁盐（磷酸哌嗪）、氯化物（氯法齐明）、硫酸盐（门冬酰胺）等杂质的检测方法原子吸收分光光度法：检查金属杂质（葡萄糖酸锌）毛细管电泳法：抑肽酶中检查去丙氨酸-去甘氨酸-抑肽酶和去丙氨酸-抑肽酶两个特定杂质色谱法：液相色谱法，检查有机杂质的主要方法薄层色谱法，作为液相色谱法的补充气相色谱法：检查挥发性杂质热分析法：检查不同晶型的杂质（影响生物利用度和稳定性）拉曼光谱法、红外光谱法、X-射线粉末衍射生物检定法、酶联免疫试剂盒（抗生素残留量）残留溶剂控制标准起草过程中，应针对所用到的有机溶剂进行检查建议采用了顶空进样方式和程序升温梯度洗脱的方法，应注意供试品溶液的配制，要求供试品在溶剂中溶解。方法学试验应进行回收试验，确认是否有基质干扰。采用标准加入法，该方法可减少基质干扰，提高方法的准确度。关于校正相对保留时间（RART）的应用。残留溶剂检测的常见问题：共出峰干扰热降解干扰基质效应的影响药品溶解性的影响溶剂介质的影响共出峰干扰共出峰：在相同的色谱条件下具有相同保留值的组分不一定是同一物质。不同的物质在某一色谱条件下具有相同保留值的现象，被称为共出峰现象。不同物质在性能（极性或氢键形成能力等）不同的色谱柱中具有完全相同保留行为的几率很小。因此采用不同极性的色谱柱分别测定，可以排除共出峰的干扰。吡柔比星中正己烷共出峰的排除色谱柱样品批号PS-117PS-118PS-119DB-624柱5.449%6.209%4.794%SPB-1柱0.569%0.631%0.579%热降解干扰如果药品对热不稳定，则可能会在直接进样或顶空加热过程中发生热降解，如果降解产物恰好与待测的有机溶剂共出锋，或恰好就是某种有机溶剂，则会导致把降解产物当作残留溶剂检测，得出错误结果。热降解原因分子结构中有烷氧基的药品可能热解产生相应的醇。排除干扰的办法改变顶空温度可以确定顶空条件下样品是否能产生热降解干扰物。也可以通过测定已知不含该溶剂的对照样品来加以判断。顶空温度头孢西丁钠头孢美唑氟氧头孢利福平70℃21.7815.526.122.7120℃1100.451309.42667.4965.2基质效应的影响和排出基质效应－－顶空分析时，因对照品溶液和供试品溶液的组成不同，使得待测挥发性组分在气液两相间的分配系数不同引起的定量误差。标准加入法可以有效地排除基质效应的影响；当标准加入法结果与内标法结果系统偏差约10%（通常偏低）时，可以认为方法存在明显的基质效应。内标法与标准加入法测定结果的比较药品名称批号或箱号残留溶剂内标法标准加入法头孢氨苄211848甲醇0.585%0.569%211850甲醇0.445%0.437%211854甲醇0.964%0.972%吡柔比星PS-117正己烷0.569%0.496%PS-118正己烷0.651%0.602%PS-119正己烷0.579%0.509%头孢哌酮钠75835031丙酮1.799%1.780%药品溶解性的影响当样品在溶解介质中未溶解时，测定结果通常偏低且精密度差。如待测溶剂为水溶性不好的溶剂，且选择水为溶媒时，可先用少量乙醇或甲醇溶解待测溶剂后再用水稀释的方法配制对照品溶液。药品溶剂介质药品的溶解性残留溶剂残留量（RSD(n=5)）头孢氨苄水微溶甲醇0.385%（4.4%）0.5mol/LNaOH溶解甲醇0.427%（1.9%）头孢泊肟酯水不溶丙酮0.0016%（73.0%）DMF溶解丙酮0.0035%（4.1%）供试品溶液的制备对水溶性药品，采用水为溶剂；当药品不溶于水，但可溶解于一定浓度的酸或碱溶液中时，可采用酸或碱溶液作为溶剂；对于非水溶性药物，可采用N,N-二甲基甲酰胺（DMF）、DMSO等为溶剂。溶液的配制应注意问题：1、为了避免残留溶剂挥发，不可用超声或加热方式溶解样品。如果采用顶空进样，样品置顶空瓶并封盖之后可以超声或加热溶解样品。2、大颗粒样品不可以研磨取样，只能取原态样品（或冷冻粉碎）。溶解介质的影响当药品在某种溶解介质中溶解后，待测溶剂或内标可能与药品产生较强的相互作用，以至采用标准加入法也无法排除对测定结果的影响。头孢呋辛酯在不同溶剂介质中对正己烷残留量测定的影响批号DMF1mol/LNaOH水溶液内标法标准加入法内标法标准加入法21360170.0023%0.0023%0.081%0.034%21360180.0036%0.0038%0.139%0.067%21360190.0036%0.0040%0.152%0.058%以1mol/LNaOH溶液为溶剂介质时，尽管对照品溶液与供试品溶液中内标丁酮的浓度相同，但是其峰面积却相差一倍；而溶剂介质为DMF时，相同浓度的丁酮内标在对照品溶液和供试品溶液中的峰面积几乎相同。以1mol/LNaOH溶液为溶剂介质时，利用内标法得到数据与标准加入法得到数据，计算对照品（正己烷）的回收率，发现对照品的回收率约为50%，超出方法可接受的范围（80-120%）。药物研发中残留溶剂研究存在问题：表述不全面或不准确。a.对色谱图中出现的未知峰未进行研究。b.试验条件未进行考察。c.方法学验证不全面。无机杂质的控制无机盐来源：来自工艺、原料或降解产物主要控制项目有：氯化物、硫酸盐、硫化物、氰化物、磷酸盐、溴化物、碘化物、重金属等氯化物取本品1.0g，加水50ml，摇匀，煮沸2－3分钟，放冷，滤过，取续滤液25ml，依法检查（附录ⅧA），与标准氯化钠溶液5.0ml制成的对照液比较，不得更浓（0.01％）。硫酸盐取本品1.0g，加稀盐酸3ml，煮沸后，放泠，加水稀释成50ml，滤过；分取滤液25ml，依法检查（附录ⅧB），与标准硫酸钾溶液5.0ml制成的对照液比较，不得更浓(0.1％)。无机杂质限度试验计算方法主要参数：限度、取样量（W）、对照溶液浓度（C）和对照溶液用量（V）。公式C（g/ml）×V（ml）限度=———————×100%W（g）有关物质控制有关物质——要求概述所有品种都应进行有关物质的考核对杂质进行定性研究，确定结构，从而为实现对已知杂质和未知杂质的区别控制，同时也为科学制订检查方法的系统适用性要求提供基础保障。优化方法（增加有效的系统适用性试验要求）限度合理有关物质的来源－起始原料－中间体、副产物－降解产物－聚合物－异构体多晶型杂质有关物质控制有关物质——关于分离及检测方法ICGCCEPC一般采用色谱法TLCLC（反相、正相、凝胶）有关物质控制有关物质——关于分离及检测方法色谱柱原则：方法验证时进行粗放度试验（三根以上色谱柱），特殊填料应在各论中予以注明，强调“或效能相当”。大多为反相高效液相法，采用C18、C8、苯基等键合硅胶填料，以C18为最常用；目前C18色谱柱类型也很多，不同基质、不同载碳量、不同封端处理方式、不同纯度、不同粒径、孔径、柱长等，影响因素较多，方法研究时应注意粗放度考察；色谱柱的差异Minutes515253545Symmetry®C18Alconc.10ppmTFUSP=1.9AmitriptylineNova-Pak®C18Alconc.=~375ppmTFUSP=6.4低金属不纯物的含量有关物质控制有关物质——关于分离及检测方法色谱柱还有的采用离子色谱法，采用离子色谱填料。例：氯膦酸二钠及注射剂，采用阴离子交换色谱柱（推荐使用IonPacAS11-HC，或效能相当）也有采用分子排阻色谱法，有的采用亲水改性硅胶；例：头孢地嗪钠有关物质Ⅱ，以球状蛋白色谱用亲水硅胶（分子量适用范围为1000～10000）为填充剂例：离子色谱（氯膦酸二钠）照离子色谱法试验用阴离子交换色谱柱（推荐使用IonPacAS11-HC，或效能相当），柱温30℃以水为流动相A，以0.1mol/L氢氧化钾溶液为流动相B，梯度洗脱，流速为1.2ml/min。检测器为电导检测器，检测方式为抑制电导检测。氯膦酸二钠原料药的有关物质与制剂的含量测定β-内酰胺类抗生素聚合物定义：药品中分子量大于药物本身的杂质总称。分子量大小：1000-5000道尔顿，个别有10000道尔顿。类别1）蛋白（多肽类）物质，来源于生产过程的残留或污染。类别2）聚合物，来源于生产、储存和使用条件下发生的分子间聚合反应物。β-内酰胺类抗生素聚合物来源方式β-内酰胺类抗生素的结构特点：β-内酰胺环。以头孢地嗪为例。聚合方式分子内聚合：反应仅和母核结构有关，侧链的活性基团不参与反应。对于7位侧链不含自由氨基的头孢菌素，如：头孢噻吩、头孢呋辛、头孢哌酮等。分子间聚合：侧链的活性基团参与反应。对于7位侧链含自由氨基的头孢菌素，如：头孢氨苄、头孢拉定、头孢噻肟等。β-内酰胺类抗生素聚合物检测方法凝胶色谱法（分子排阻色谱法）：是根据分子大小进行分离的一种液相色谱技术。原理：色谱柱多以亲水硅胶、凝胶或经修饰凝胶如葡聚糖凝胶Sephadex和聚丙烯酰胺凝胶Sepherose等为填充剂，这些填充剂表面分布着不同尺寸的孔径，药物分子进入色谱柱后，它们中的不同组分按其大小进入相应的孔径内，大小大于所有孔径的分子不能进入填充剂颗粒内部，在色谱过程中不被保留，最早被流动相洗脱至柱外，表现为保留时间较短；大小小于所有孔径的分子能自由进入填充剂表面的所有孔径，在柱子中滞留时间较长，表现为保留时间较长；其余分子则按分子大小依次被洗脱。中国药典方法(I)采用交联葡聚糖凝胶（Sephadex）为分离柱。以水和磷酸盐缓冲液分别进行洗脱，前者进行对照品的测定，后者进行样品的测定。以葡聚糖2000作为系统适用性试验的标志物，以葡聚糖2000峰的理论板数、拖尾因子，和其在两套系统中的保留时间比值，以及该峰与对照品溶液峰和供试品溶液聚合物峰的保留时间比值作为系统适用性试验的主要指标。典型的供试品溶液色谱图两套流动相系统的用意由于中压液相系统会造成样品溶液中主成分峰的严重扩散，使面积归一法和自身对照法计算杂质失去意义。因此，需采用另一套系统将主成分快速洗脱出来。为保证两套系统中对照品峰与供试品溶液中聚合物峰有可比性，所以需要葡聚糖2000作为标志物。现行方法存在的问题分离度差：经常出现台阶状，或根本分不开精密度差：对照品溶液5针精密度在5-7%，甚至10%。响应值低：使限度与实际值相差很远。操作繁琐：两套液相系统，试验时间长。试验中应注意的问题原规定柱内径1..3—1.6cm，柱长30—40cm，通过实验发现，柱内径减少至1cm，柱长30—40cm亦可达到良好的分离效果。同时聚合物保留时间在流速约为1ml/min时可小于10分钟，使实验周期缩短。分离度也有一定的提高。流动相A中缓冲液浓度减低有利于提高聚合物检测灵敏度适当的洗脱速度可获得合适的高聚物分离度