低温胁迫对玉米叶片抗寒性的影响

低温胁迫对玉米叶片抗寒性的影响生科1301张一鸣（东北农业大学生命科学学院黑龙江哈尔滨150030）摘要：由于低温可使幼苗的细胞膜脂发生改变，破坏膜结构，引起代谢紊乱，对植物造成伤害。为验证其伤害程度，本实验以九龙和利禾两种玉米幼苗为原料，以低温处理0h为对照组，4℃处理12h，24h为实验组，分别进行叶绿体色素含量测定，过氧化物酶活性测定，电导仪法测定植物细胞质膜透性实验来研究玉米叶片的抗寒性与抗冷性。结果表明低温对玉米叶片造成极大影响，主要表现在叶绿体含量的降低，植物叶片电导率先上升后下降，过氧化氢酶逐渐降低。可知低温玉米叶片受伤害程度与低温持续时间，温度密切相关。关键词：玉米抗寒性低温胁迫叶绿体色素含量过氧化物酶活性电导仪法测细胞质膜透性前言：植物固着于某地生长，难以迁移，因此易于受到环境如冻害，冷害【1】等影响。研究低温胁迫与植物抗寒性的机理，有助于植物高产与当地生态环境的维护。据统计，地球上只有不足10%的陆地适合栽种农作物【2】，而在这10%的陆地上所产生的农作物，因冻害所导致的经济损失，每年高达数千亿美元【3】，例如仅在我国东北地区1969,1972,1976年的三次冻害每年均减产至少50亿千克【4】。对于温带园林，高寒地带移栽作物等，减免低温对植物的影响更是重中之重，特别是我省黑龙江处于高寒地区，本实验对于植物抗寒性的研究更具实际意义。1.材料与方法1.1材料：九龙，利禾玉米种子，由东北农业大学生命科学学院植物生理教研室提供。1.2方法1.2.1玉米幼苗的培养分别取九龙，利禾玉米种子各300粒左右进行消毒，然后用蒸馏水将玉米种子洗净，在75%乙醇中消毒15s，浸种催芽处理12h后，用蒸馏水洗三次，洗去种子表面抑制生长的物质，然后进行沙培，将沙子平铺在培养盘上，用喷壶浇适当的完全营养液。将种子放在沙子上，种脐向上，种子间距离适当。种子上覆盖适当的沙子，约1cm厚，保证沙子湿度适当，培养条件为20℃，浇以全素营养液，使生长健康。当植物长出四片真叶时进行试验，低温胁迫玉米幼苗并测定其5项生理指标。1.2.2处理方法将每个品种的供试材料分为三组，一组于原处继续生长，一组移至4℃冰柜低温胁迫处理12h，另一组移至4℃冰柜进行低温胁迫处理24h，分别作为常温对照和低温处理处取材测定其生理生化指标。1.2.3生理指标的测定1）叶绿素含量—分光光度计—乙醇法1.称取剪好的新鲜玉米叶片0.2g，放入研钵中，加入少量石英砂与碳酸钙及8ml提取液，研磨成匀浆，室温静置3—5min后转到10ml离心管中，4000r/min离心5min，取上清液倒入容量瓶定容至25ml。2.将提取液倒入比色杯中，以95%乙醇为空白，在波长为649nm,665nm下测定吸光度。3.计算：Ca=13.95*A665-6.88*A649Cb=24.96*A665-7.32*A665CT=Ca+Cb叶绿体色素含量（mg/g）=CT*V*N/W式中：CT——色素浓度（mg/ml）V——提取液体积（ml）N——植物组织鲜重（g）W——稀释倍数2）过氧化物酶活性——愈创木酚法1.称取0.5g叶片，剪碎，放入研钵中，加适量磷酸缓冲液（pH5.5）研磨成匀浆，将匀浆倒入离心管，4000rpm，离心10min，取上清液，定容至10ml。2.酶活性测定的反应体系包括2.9ml0.05M磷酸缓冲液；1.0ml2%H2O2；1.0ml0.05愈创木酚和0.1ml酶液。用加热煮沸5min的酶液作对照组，反应体系加入酶液后，立即于37℃水浴中保温15min，并加入2.0ml20%的三氯乙酸终止反应，在470nm波长下测吸光度。3.计算：过氧化物酶活性=（A470*VT）（0.01*W*VS*t）A470——反应时间内吸光度变化W——样品鲜重t——反应时间VT——提取酶液总体积Vs——测定取用酶液体积3）植物细胞质膜透性——电导仪法1.用6—8mm打孔器打取叶圆片，每组30片，分装3只称量瓶。2.每瓶各加10ml去离子水，于针筒中抽去细胞间空气，水渗入细胞间隙，叶片呈半透明状，沉入水下，室温防止1h。3.将各瓶充分摇匀，用电导率仪测初电导值（s1）4.将各瓶置沸水浴10min，杀死植物组织，取出称量瓶，冷却至室温，在室温下平衡10min，摇匀，测最终电导值（s2）5.计算：相对电导率（L）=（S1-S0）/（S2-S0）伤害率（%）=（L1-Lck）/（1-Lck）S0——蒸馏水电导率S1——煮沸前电导率S2——煮沸后电导率L1——低温处理时叶片的相对电导率Lck——对照（室温下）叶片的相对电导率2结果与分析2.1低温胁迫对叶绿素含量的影响初始数据：初始数据九龙利禾叶绿素吸光值A649A665A649A6650h0.4441.0340.4391.0420.4421.0480.4391.0460.4531.0280.4441.05112h0.3330.7150.5971.3870.3190.6820.5771.3770.3460.7490.5971.39224h0.430.9460.4671.1350.4430.9490.4681.1410.4410.9650.4641.136实验结果：九龙叶绿素含量测定CA(mg/L)CB(mg/L)叶绿素含量(mg/g)0h11.264.041.9112h7.683.081.3524h10.303.881.77利禾叶绿素含量测定CA(mg/L)CB(mg/L)叶绿素含量(mg/g)0h11.563.351.8612h15.264.592.4824h12.663.312.00叶绿素在光能转化为生物能的过程中起到重要作用，实验数据显示，九龙玉米在低温处理12h的时候，其叶绿素含量低于0h与24h；利禾玉米，在低温处理12h的时候，其叶绿素含量最高，这与理论值不同。正常状况下，随着低温处理时间的增加，植物体叶绿素遭到破坏，其含量降低。经讨论分析，产生误差的原因应该是实验操作误差以及低温处理时，植物受到光照强度不同体内叶绿素合成情况不尽相同，属于实验设计误差。就叶绿体色素含量看来，利禾玉米叶绿素含量更高，利禾在这一方面的品质更优。2.2过氧化物酶活性的测定初始数据：原始数据九龙利禾0h0.1010.2170.0870.22412h0.1380.1730.130.1724h0.1310.1540.1390.158平均过氧化氢酶吸光值A470A4700h0.0940.22112h0.1340.17124h0.1350.156实验结果：过氧化氢酶九龙活性（μ）利禾活性（μ）0h125.33294.6712h178.6722824h180208过氧化氢酶普遍存在于植物的所有组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能力有一定关系，故常加以测定。环境逆境往往先抑制酶促防御体系的活性,再进一步对细胞造成伤害。低温下导致酶促反应平衡的破坏与原生质膜凝固,氧化酶和过氧化氢酶活性降低,体内因积累过多的过氧化氢而中毒。低温影响了相关RNA的转录、翻译，以及各种酶的生理活性，从而使过氧化物酶的合成减少。植物为抵御低温而水解体内的部分蛋白质，使游离氨基酸，特别是脯氨酸的量增加，过氧化物酶的分解加剧，从而使其相对含量降低。[5]2.3电导仪法测细胞质膜透性初始数据：初始数据九龙利禾S0电导率S1S2S1S24.610h35.324461.628312h93.8282127.431824h86.135879.5340实验结果：结论数据九龙利禾相对电导率L1（μs/cm）伤害率L2（μs/cm）伤害率0h0.128—0.205—12h0.32222.18%0.39223.53%24h0.23111.75%0.2232.34%当植物组织受到低温伤害的时候，其膜功能受损，细胞内盐类与有机物不同程度流失，导致溶液电导率发生改变，伤害越重，电导率越高，从上图表中我们可以看出，在4℃的条件下，无论九龙还是利禾，其12h的伤害率高于24h的伤害率。经讨论分析，12h的电导率大于24h电导率可能是由于低温处理时间过长导致植物将受损细胞流失的有机物质再利用，使得溶液电导率降低，而12h时，九龙与利禾伤害率接近，可认为两种植物在此方面上相同。3.讨论：在低温条件下，植物组织出现受害症状。如生长放慢，叶片失绿。遭受冻害的植物光合作用和物质运输受到抑制，呼吸降低，酶活性减弱，分解加强，电解质外渗。研究表明低温伤害的原初部位是生物膜。低温条件下，生物膜流动性降低，酶促代谢等受到抑制，从而引起伤害，各项生理指标也相应发生变化。4.结论：结果发现低温胁迫使得玉米幼苗叶绿素含量、过氧化物活性降低，电导率升高。在耐低温胁迫方面，九龙较利禾抗逆性更强。玉米是温度敏感型作物，易遭受低温冷害的影响。而我省易发生寒流等低温灾害，因此研究玉米在不同地区不同情况下的抗寒性十分重要。参考文献：[1]李合生苍晶王学奎，等。植物的逆境生理【J】。植物生理学（第三版）,2011,12.2.1.1,361[2]李合生夏凯于晶，等。植物的逆境生理【J】。植物生理学（第三版）,2011,12,355[3]LINSZ,ZHANGZY,LINYZ,etal.TheruleofcalcuimandcalmodulininfreezingresistanceofPopulustomentosacuttings[J].journalofPlantPhysiologyandMolecularBiology,2004,30;59—68[4]王立刚，邱建军，等基于GIS的东北地区水稻低温冷害区划研究[J],江苏农业大学学报，2009（31）:494—498[5]苍晶.赵会杰，等。过氧化物酶活性测定【J】。植物生理学实验教程，2013.4；150—151[6][7][8]