HIV实验室检测及规范操作课件

HIV实验室检测及规范操作xxx艾滋病检测的方法HIV抗体检测HIV抗体初筛检测HIV抗体确认检测（免疫印迹试验）HIV核酸检测▪核酸序列依赖性扩增（NASBA）▪HIV定量逆转录PCR系统（RT－PCR）▪HIVRNA定量检测的分支测定法（bDNA)艾滋病检测方法的意义HIV抗体检测酶联免疫吸附试验▪间接法▪直接法（双抗原夹心法）▪抗体竞争法明胶颗粒凝集试验（PA）快速法HIV/AIDS的筛查，但初筛阳性结果不能做为艾滋病诊断依据，需将该标本送地区筛查中心实验室用两种方法进行复核，仍为阳性或一阴一阳则须送省确认中心。艾滋病检测方法的意义HIV抗体确认检测（免疫印迹试验）HIV/AIDS诊断的唯一依据,省CDC确认实验室负责全省监测哨点以及常规检测中阳性及可疑标本的确认和省内HIV初筛实验室的质量管理.另外,省检疫系统有一个确认实验室,设在省检疫局保健中心.艾滋病检测方法的意义HIV核酸检测►辅助诊断：在特殊情况下，如出现某些非典型的抗体反应，特别是不确定反应时，RNA的测定可提供有用的证据。►感染早期：在HIV感染的窗口期，无法使用抗体检测进行诊断，此时RNA的测定具有特殊的意义，提示是否有感染的可能，但仍需追踪检测HIV抗体，最终根据抗体的检测情况做出诊断。►病程监控：帮助确定疾病发展的阶段。►指导治疗方案及疗效测定►预测疾病进程国家对HIV抗体检测试剂的要求◆初筛试剂筛查试剂必须是HIV1+2混合型的、经国家食品药品监督管理局注册批准、批批检合格、临床评估质量优良、在有效期内的试剂。◆确认试剂必须经国家食品药品监督管理局注册批准。我国常用的HIV抗体检测试剂►HIV抗体筛查试剂▪酶联免疫：初筛实验室的常用基本试剂。▪明胶颗粒凝集▪其它快速诊断试剂：在尚未建立艾滋病筛查实验室的偏远地区由经过培训的技术人员在规定的场所使用。►HIV抗体确认试剂▪免疫印迹试剂快速检测试剂的优缺点硒标记法和金标记法与ELISA相比►优点所需时间短操作简便，不需特殊设备。试剂贮存于室温。►缺点特异性和敏感性与ELISA有差距。费用较高。HIV抗体检测程序及流程图1、筛查试验标本验收合格后，用筛查试剂进行检测，如呈阴性反应，报告为HIV抗体阴性；对呈阳性反应的标本须进行重复检测。2、重复检测用原有试剂和另外一种不同原理或不同厂家的试剂重复检测，如两种试剂复测均呈阴性反应，则报告HIV抗体阴性；如均呈阳性反应，或一阴一阳，需送艾滋病确认实验室进行确认。3、筛查试验的流程图样品筛查检测筛查试剂阳性反应重复检测均阳性反应一阴一阳送确认实验室进行确认均阴性反应阴性报告阴性反应原有试剂加另一种筛查试剂HIV抗体筛查结果的报告和处理►筛查试验呈阴性反应，出具HIV抗体阴性报告（提示应考虑窗口期的可能）。►筛查试验呈阳性反应，可出具“HIV待复查”报告，不能出阳性报告。同时尽快进行以下处理：▪填写HIV阳性标本送检单，并随标本送至当地筛查中心实验室，或直接送确认实验室。▪筛查中心实验室应尽快用两种试剂进行复测，如结果均阳性或一阴一阳，则应将该标本和送检单一并送至省艾滋病确认实验室确认。▪阳性标本必须送省确认中心，筛查实验室不能随意处理。▪做好检测后的咨询结果的解释问题:HIV抗体检测结果阴性是否表明未感染?对不确定结果如何解释?怎么样知道婴儿是否感染了HIV?HIV抗体初筛检测结果解释阴性(1)未感染HIV(2)可能感染了HIV,但处于窗口期,或HIV-1/2抗体和HIV-1O亚型抗体低于检测下限。(3)疾病晚期,免疫功能缺损,抗体可能呈阴性.确认阳性感染了HIV,样品含有HIV-1/2抗体和HIV-1O亚型抗体(未满18个月的婴儿除外).不确定:建议追踪检测.HIV抗体初筛检测结果解释什么是不确定结果？HIV抗体确认试验时,试验条带上出现的蛋白带型不足以判断为HIV抗体阳性,应建议其3个月后复查.►如果复查结果阳转,表明受检者已感染HIV;►如复查时条带全部消失,则为阴性结果;►如复查时条带没有变化或有变化但仍不足以判断为阳性,则应建议其3个月后再复查一次,如还不能判断为阳性结果,则应作为阴性对待.HIV抗体初筛检测结果解释造成检测结果不确定的原因(1)处于窗口期,血清中还没有形成典型的HIV抗体。(2)艾滋病进展到终末期,人体免疫力缺陷,抗体水平下降。(3)与其他非病毒蛋白抗体有交叉反应.自身免疫性疾病、恶性肿瘤、怀孕、输血或器官移殖等，此时，身体产生的一些抗体与Ｐ２４核心蛋白抗体相似。(4)以前接种过HIV疫苗。HIV抗体初筛检测结果解释如何判断婴儿是否感染了HIV？通过胎盘，感染了HIV的母亲所生的婴儿可能带有来自母体的HIV抗体，此时HIV抗体检测阳性并不意味着已被感染。►建议在婴儿9个月时进行HIV初筛检测如阴性，则判定为未感染HIV。如阳性，则应在婴儿18个月时进行复检阴性：判定为未感染。阳性：则将血样送至省CDC确认中心进行HIV抗体的确认试验。HIV抗体初筛检测酶联免疫吸附试验（enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA）ELISA法中有间接法、夹心法和竞争法。目前使用最多的是夹心法。HIV抗体初筛检测（ELISA实验原理）酶球（酶标记抗原）抗体HIV抗体初筛检测ELISA夹心法原理将HIV抗原包被到固相载体上，标本中的HIV抗体与包被的HIV抗原结合形成复合物，利用抗体的多价性，又与酶（HRP）标记的同类HIV抗原也即酶标板内的球状复合物，形成一个HIV抗原抗体酶标记的HIV抗原复合物，最后加入底物，避光30分钟，在酶作用下，产生显色反应，加2N硫酸终止后呈黄色，在450/620nm双波长下测定光密度值，与标准进行比较，以判定标本的结果。HIV抗体初筛检测材料标本，试剂盒，酶标仪和洗板机，其它试验基本材料。方法以荷兰阿克苏试剂盒为例⑴实验前试剂应在室温下放置30分钟，使用后试剂放回2~8℃⑵配制洗液1×25洗液用蒸馏水1：25稀释。稀释后可在2~8℃稳定2周。⑶TMB与尿过氧化物溶液等量混合准备成TMB底物。因其稳定性有限，所以应现用现配。配制后的TMB底物为无色，在避光下可以稳定6个小时。HIV抗体初筛检测（阿克苏ELISA）⑷每孔加入100ul血清稀释液，注意不准碰到孔内的酶球。⑸在所确定的孔中加入50ul血清标本或对照；设3孔阴性、1孔HIV-1阳性、1孔HIV-2阳性对照。⑹混匀，盖上贴膜放入37℃环境孵育1小时。孵育结束前5分钟，准备充足的TMB底物液。⑺撕去贴膜，用新配制洗涤液洗板（洗板次数根据试剂盒要求）。吸干，每孔加入100ulTMB底物液。⑻置室温（18~25℃）闭光孵育30分钟。⑼每孔加入100ul2N硫酸终止反应。⑽在450nm（单波长）或450/620nm（双波长）读取光密度值（OD值）（应在终止反应2小时内进行读数）。HIV抗体初筛检测（阿克苏ELISA）结果判定⑴阴性对照（NegativeControl,，NC）的参考标准NC必须＜0.250，去除≥0.250的各孔；计算剩余NC的平均值（NCx）0.6NCx＜NC＜1.4NCX,如果有一个以上超出此范围，去除后重新计算NCx。⑵判定实验有效性：至少有2个阴性对照OD值有效。PC1-NCx≥0.400（PC1：HIV-1抗体阳性对照值）PC2-NCx≥0.400（PC2：HIV-2抗体阳性对照值）HIV抗体初筛检测（阿克苏ELISA）⑶临界值（Cutoff）如果实验有效，按照公式计算界限值：Cutoff=NCx+0.100⑷实验结果判定如果OD值≥Cutoff值，则样品为阳性；如果OD值＜Cutoff值，则样品为阴性。HIV抗体初筛检测（阿克苏ELISA）＊计算举例NC=0.089；0.093；0.091PC1=1.155PC2=1.069NCx=0.091清除异常的质控对照去除NC≥0.250，无去除去除NC＞1.4NCx1.4×0.091=0.127无去除去除NC＜0.6NCx0.6×0.091=0.055无去除确定下列条件满足PC1-NCx≥0.4001.155-0.091=1.064通过PC2-NCx≥0.4001.069-0.091=0.987通过计算临界值Cutoff=NCx+0.100=0.091+0.100=0.191HIV抗体初筛检测（阿克苏ELISA）注意事项⑴超过有效期的试剂不能使用，样品和试剂应处于室温，使用后试剂放回2-8℃。⑵为了避免污染，不要用手指或加样器尖接触酶标板孔及孔内的酶复合物。⑶所有的加样步骤要精心准确，试剂或样品的交叉污染会引起错误的结果，避免微生物或其它污染物污染。⑷清除酶标板孔内的气泡，如果需要，轻轻拍打板架。⑸洗板机要经常保养，避免交叉污染。HIV抗体初筛检测（阿克苏ELISA）⑹非重复有活性反应结果（假阳性）可能属于下列一个或多个技术问题引起：①由于仪器或加样器尖造成的交叉污染。②底物被金属离子污染。③由于潮湿或试剂滴漏造成的交叉污染。④不充分的洗板或最后吸去不彻底。⑤读数错误，在酶标板底部有水滴或在酶标板孔内有气泡。HIV抗体检测明胶颗粒凝集试验（gelatinparticleagglutination,PA)以日本富士药厂和珠海丽珠试剂厂生产的试剂盒为例原理经HIV抗原致敏的明胶颗粒与血清中的抗体发生特异性抗原-抗体结合并产生肉眼可见的凝集反应。优点操作简便，快速，无需特殊仪器设备，适合门诊少量标本的检测。HIV抗体检测（明胶颗粒凝集试验）材料血清标本,U型板,PA试剂盒(“A”溶解用液,”B”血清稀释液,”C”致敏颗粒,”D”非致敏颗粒,阳性对照血清,专用滴管.方法(1)从4℃冰箱取出试剂盒,恢复至室温后使用.(2)从1:4开始做倍比稀释.(3)用专用滴管,第二孔加1滴(25ul)非致敏颗粒”D”,第三孔加1滴(25ul)致敏颗粒”C”.(4)轻轻拍打微量板或在振荡器上振荡1分钟混合后,室温(20℃)静置2小时后观察结果.HIV抗体检测（明胶颗粒凝集试验）结果判断明胶颗粒沉积在孔底,周边平滑,或形成致密圆圈者为阴性结果.(-)明胶颗粒沉积在孔底,中央形成致密小环,周边平滑为可疑反应.(+_)孔内有清晰的宽环且外缘粗糙者,为阳性结果.(+/++)孔内凝聚颗粒形成均一的膜覆盖在整个孔底者为强阳性反应.(+++/++++)孔内样品与致敏和非致敏颗粒均产生凝集者,则需作重吸收试验后进一步检测.确认试验的试剂必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、在有效期内的试剂。确认试验方法包括免疫印迹试验（WB）、条带免疫试验（LIATEKHIVⅢ）、放射免疫沉淀试验（RIPA）及免疫荧光试验（IFA）。国内常用的确认试验方法是WB。HIV抗体确认试验确认检测流程有HIV-1/2混合型和单一的HIV-1或HIV-2型。先用HIV-1/2混合型试剂进行检测，如果呈阴性反应，则报告HIV抗体阴性；如果呈阳性反应，则报告HIV-1抗体阳性；如果不满足阳性标准，则判为HIV抗体检测结果不确定。如果出现HIV-2型的特异性指示条带，需用HIV-2型免疫印迹试剂再做HIV-2的抗体确认试验，呈阴性反应，报告HIV-2抗体阴性；呈阳性反应则报告HIV-2抗体血清学阳性,并将样品送国家参比实验室进行核酸序列分析。HIV抗体确认检测流程免疫印迹法（WB，HIV-1/2混合型）HIV-1阳性反应不确定反应出现HIV-2指示条带报告HIV-1阳性不确定反应阳性反应阴性反应报告阴性每3个月随访1次，共2次，仍属可疑，则报告阴性；如随访期间HIV抗体出现阳性反应则报告阳性。随访期间可根据需要，检测病毒核酸和或P24抗原，作为辅助诊断。阴性反应报告阴性筛查试验阳性反应样品报告HIV-2血清学阳性免疫印迹法（WB\HIV-2）艾滋病实验室诊断确认试验(蛋白印迹Western-Blot)试验原理病毒裂解物抗原经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分离,然后将分离后的抗原转移(印迹)到硝酸纤维薄膜上,采用类似ELISA的技术,当样品中含有HIV抗体时,它和印迹在硝酸纤