遗传病的诊断和咨询-终板

1课前提问1.什么叫做血红蛋白病？血红蛋白病的类型有哪些，请简单描述？2.试述镰形细胞贫血症的发病机制。3.α地中海贫血包括哪些类型，其基因型及临床表现如何？4.苯丙酮尿症有哪些主要的临床症状？试述其分子机制。遗传病的诊断P220第十七章DiagnosisofGeneticDisease教学要求掌握系谱分析、产前诊断、基因诊断的概念；遗传病诊断的主要方法，尤其是实验室检查的主要方法及染色体检查的适应证。熟悉孟德尔式遗传病的系谱分析法，非孟德尔式遗传病和特殊遗传方式的疾病；产前诊断常用方法及最佳诊断时间；产前诊断的适应证。了解生物化学检查的适用范围。3概述遗传病的诊断包括：一般诊断（病史、症状、体征、实验室检查）特殊诊断（系谱分析、染色体检查、特殊生化检测、基因诊断）目前，临床对遗传病的诊断包括：临症诊断、症状前诊断、产前诊断和植入前诊断4第一节临症诊断和症状前诊断临症诊断（symptomaticdiagnosis）是根据患者的各种临床表现进行检查、确诊和判断遗传方式，是遗传病诊断的主要内容。症状前诊断（presymptomaticdiagnosis）则是对遗传上异常的个体（针对一些发病较迟的常染色体显性遗传病患者）采用各种措施，使他们在出现症状前从遗传上予以确认。1、病史：家族史、婚姻史、生育史2、症状和体征：PKU、半乳糖血症、性染色体病6一、病史、症状和体征二、家系分析从先证者入手，调查其亲属的健康及生育状况，将调查材料绘制成系谱图进行系谱分析，大大有助于区分单基因病和多基因病，以及遗传方式。由于各种单基因遗传病常表现出特定的孟德尔式遗传，所以，系谱分析常有助于单基因病的诊断。7三、细胞遗传学检查即染色体检查与核型分析，是较早应用于遗传病诊断的辅助手段，能较准确地判断和发现染色体数目和结构异常综合征，因而该方法是确诊染色体病的主要方法。81．染色体检查亦称核型分析（karyotypeanalysis）是确诊染色体病的主要方法。随着显带技术的应用以及高分辩率染色体显带技术的出现和改进，能更准确地判断和发现更多的染色体数目和结构异常综合征，还可以发现新的微畸变综合征。92．性染色质检查优点是方法简单，主要用于疑为两性畸形或性染色体数目异常的疾病诊断或产前诊断，有一定价值，但确认仍需依靠染色体检查。103、染色体原位杂交：应用标记的DNA片段与玻片上的细胞、染色体或间期核的DNA杂交，在样品核酸不改变其结构和分布格局的情况下，研究核酸片段的位置、相互关系。114、荧光原位杂交（FISH）：应用荧光素标记的DNA探针与标本进行原位杂交后，使杂交区域发出荧光。优点：快速、安全灵敏度高特异性强12图示为18三体综合征患者的FISH检测染色体检查的指征：①有明显的智力发育不全、生长迟缓或伴有其他先天畸形者；②夫妇之一有染色体异常，如平衡易位、嵌合体等；③已生育有染色体或先天畸形患儿的夫妇；④多发性流产妇女及其丈夫；⑤原发性闭经和女性不育症；⑥无精子症男子和男性不育症；⑦两性畸形者；⑧疑为先天愚型的患儿及其父母；⑨原因不明的智力低下伴有大耳、大睾丸和（或）多动症者；⑩35岁以上的高龄孕妇（产前诊断）。13四、生化检查生化检查主要用于生化遗传病的检测（对由于基因突变所引起的酶和蛋白质定量和定性分析）。主要针对三方面：1）蛋白、酶活性；2）反应底物、代谢中间产物或终产物的浓度；3）受体的结合能力。例如疑为苯丙酮尿症患者，可检测血清苯丙氨酸或尿中苯丙酮酸的浓度。14五、基因诊断（第三节）采用分子生物学方法在DNA水平或RNA水平对某一基因进行分析，从而对特定的疾病进行诊断（genediagnosis）。基因诊断是症状前诊断的主要手段。151978年，华裔美国学者简悦威（Yuet-WaiKan）首次采用DNA重组技术对血红蛋白病进行产前诊断，开创基因诊断的先河。目前，基因诊断早已进入欧美各国的临床应用，不仅针对遗传性疾病，而且用于对一些感染性疾病和肿瘤的诊断。基因诊断的特点（优点）：171.以特定基因为目标，检测基因的突变和表达信息，特异性强；2.采用分子杂交技术和PCR技术具有信号放大作用，微量样品即可进行诊断，灵敏度高；3.可用于尚无出现临床表现前，胎儿的出生前诊断，群体筛查等，应用广泛；4.检测样品获得便利，不受个体发育阶段性和基因表达组织特异性的限制。基因诊断的样本：可以是任何有核细胞，包括：1、外周血白细胞、口腔粘膜细胞2、活检标本、石腊包埋的组织块3、沉淀细胞（唾液、痰液、尿液）4、羊水细胞、绒毛细胞、进入母体循环的胎儿细胞应用PCR，样本可微量化到一个细胞18基因诊断的基本技术：核酸分子杂交聚合酶链反应（PCR）DNA测序技术19Southernblot印迹杂交通过用已知基因的DNA片段制备探针与待测基因组DNA的限制性酶切片段进行杂交，分析带谱。可直接确定致病基因的缺陷。是最经典、应用最广泛的分子遗传学技术。常用于基因缺失。2021aa/aaaa/-aa/a-a-/----/-14kb10kb10kb4kbBamHIBamHI左侧：16号染色体上携有数目不同的基因右侧：a基因探针杂交的结果-地贫基因缺失的诊断正常贫血症状携带者HbH22镰状细胞贫血的基因诊断限制性内切酶MstⅡ切割的序列是CCTNAGG（其中N是任何一种核苷酸），切割正常DNA产生1.1kb珠蛋白的DNA片段；若切割患者DNA时，由于AT破坏了MstⅡ的位点，便形成1.3kb珠蛋白的DNA片段。酶解正常人DNA和患者DNA，用标记的珠蛋白基因为探针作Southern杂交PolymeraseChainReaction(PCR)Amethodtoamplifyspecificgeneticsequences.24Template(DNAorRNA)TwoprimersdNTPsPCRbufferKCl,Tris,MgCl2ThermostableDNAPolymerase(Taq)PCRReagentComponents反应体系：25PCRCycle：STEPSDenaturation:DNAstrandsseparate.94oCAnnealing:PrimersbindtoDNA.65-40oCExtension:NewDNAissynthesized.72oC26Cycle1Cycle2Cycle3GeometricAmplification：After30cycles,theDNAisamplifiedoverabillionfold.27基于PCR技术的DNA诊断:PCR直接扩增（大片段缺失）PCR/ASO、PCR/SSCP、PCR/DGGE联合应用（点突变的检测)PCR/Southernblot联合应用（三核苷酸重复相关遗传病）28多重PCR：在同一PCR体系中加入数对PCR引物，可同时扩增多个DNA片段。常用来检测同一基因的多个外显子的缺失。29DNA测序法：DNA测序（DNASequencing)是检测未知突变和已知突变基因的最基本和最重要的实验手段。30基因芯片又称DNA芯片，（DNAarray）.指把成千上万个寡核苷酸或cDNA探针密集、规律地排列在1cm2大小的硅片或玻璃芯片上，容量可达20～40万个基因探针。将荧光标记的DNA或cDNA样品送到在芯片上与探针杂交，经激光共聚焦显微镜扫描，以计算机系统对荧光信号做出比较和检测，可迅速得出所需的信息，比常规方法快几十到几千倍。31DNAmicroarraysonglassslides32应用实例Affymetrix公司，把P53基因全长序列和已知突变的探针集成在芯片上，制成P53基因芯片，将在癌症早期诊断中发挥作用。Heller等构建了96个基因的CDNA微阵，用于检测分析风湿性关节炎(RA)相关的基因，以探讨DNA芯片在感染性疾病诊断方面的应用。现在，肝炎病毒检测诊断芯片、结核杆菌耐药性检测芯片、多种恶性肿瘤相关病毒基因芯片等一系列诊断芯片逐步开始进入市场。33G6PD缺乏症检测芯片由G6PD基因的突变、插入和缺失引起。根据已知的基因突变型可设计突变基因探针，制成芯片可同时检测中国人种的8种突变类型，覆盖率达90%以上，并能精确确定突变类型及纯、杂合状况。操作时间短（4小时以内），适于大批量检定。34第二节产前诊断和植入前诊断产前诊断（prenataldiagnosis）是以羊膜穿刺术和绒毛取样等技术，对羊水、羊水细胞和绒毛进行遗传学和生化检查分析，对胚胎或胎儿的染色体和基因进行分析诊断，是预防遗传病患儿出生的有效手段。母婴保健法规定：第二十条孕妇有下列情形之一的，医师应当对其进行产前诊断：（一）羊水过多或者过少的；（二）胎儿发育异常或者胎儿有可疑畸形的；（三）孕早期接触过可能导致胎儿先天缺陷的物质的；（四）有遗传病家族史或者曾经分娩过先天性严重缺陷婴儿的；（五）初产妇年龄超过35周岁的。36一、产前诊断的对象：①夫妇之一有染色体畸变，特别是平衡易位携带者，或生育过染色体病患儿的夫妇；②35岁以上的孕妇；③夫妇之一有开放性神经管畸形，或生育过这种畸形患儿的孕妇；④夫妇之一有先天性代谢缺陷，或生育过这种患儿的孕妇；⑤X连锁遗传病致病基因携带者孕妇；⑥有习惯性流产史的孕妇；⑦羊水过多的孕妇；⑧夫妇之一有致畸因素接触史的孕妇；⑨有遗传病家族史，又系近亲结婚的孕妇。二、产前诊断的方法1、无创伤性方法:母亲血清、尿液的生化检查、B超、CT、X线、MRI2、有创伤性方法：根据妊娠时间及检测目的有针对性地选用不同的穿刺取样技术，然后将样品进行实验室检查（细胞遗传学、生化检查、基因诊断）。羊膜穿刺术、绒毛吸取术、脐带穿刺术38B超是一种相对安全无创的检测方法，是首选的诊断方法，能够详细检查胎儿的外部形态和内部结构，可对多种遗传性疾病进行早期诊断，这些疾病包括，神经管缺陷、脑积水、无脑畸形；唇、腭裂，颈部淋巴管瘤；先天性心脏病；支气管、肺部发育异常，胸腔积液；肢体缺陷；先天性单侧肾缺如、多囊肾；先天性幽门狭窄、先天性巨结肠等。取样方法取样时间待测样品羊膜穿刺术孕15-17周脱落细胞绒毛吸取术孕10-11周绒毛膜细胞脐带穿刺术孕18周脐带血细胞40羊膜穿刺术：41孕15-17周羊膜穿刺术指征：高龄孕妇异常的母体血清三倍体标记筛查结果染色体异常家族史神经管缺损/异常母体血清甲胎蛋白生化检查或DNA分析检测的孟德尔遗传病42优点：发生感染、流产及其他妇科合并症的风险相对较小（约1%）缺点：检查时间较晚43羊膜穿刺术的优缺点：绒毛吸取术（绒毛取样法）44绒毛样本可用于诊断染色体病，代谢病，胎儿性别鉴定，生化检测和DNA分析。孕10-11周优点：检查时间早，根据检测结果认为有必要进行选择性流产时，给孕妇带来的损伤和痛苦相对较小。缺点：取样标本容易被污染，胎儿和母体易感染和操作不便等，引起流产的风险是羊膜穿刺法的2倍。45绒毛取样的优缺点：脐穿刺是在B超的监护下，用细针经腹壁、子宫壁进入胎儿脐带，并抽取胎儿血液样本进行诊断。本方法适宜妊娠18周进行，常作为因错过绒毛或羊膜穿刺取样最佳时机，或羊水检查失败的补救措施，还可检测胎儿血液系统疾病，先天性免疫缺陷等。胎儿镜检查又称羊膜腔镜或宫腔镜检查。宫腔镜进入羊膜腔后，直接观察胎儿是否有畸形、性别和发育状况如何，可以同时抽取羊水或胎儿血样进行检查，还可进行宫内治疗。因此，理论上这是一种最为理想的方法。但由于操作困难和易引起多种并发症，目前还不能被广泛接受。胎儿镜检查的最佳时间是妊娠18～20周。分析孕妇外周血中的胎儿细胞以及游离的胎儿DNA或RNA利用妊娠期少量胎儿细胞可以通过胎盘进入母体血液中这一现象，采用流式细胞仪分离、磁激活细胞分选、免疫磁珠法、显微操作分选法以及分子细胞遗传学技术等，分离和分析胎儿有核细胞以及血清中游离的胎儿DNA或RNA，从而进行无创性基因诊断。新进展：着床前诊断在受精6天胚胎着床前进行。优点：既可避免分娩患儿，又不必行流产术49