2012生化实验设计蚕豆病

▶年级、专业、班级：2012影像二大班▶实验课时间：星期二下午▶实验室：第三实验室▶组别：第三组▶组员：屈云香、王依影、王娜、杜红香▶报告人：徐成航、肖兴辉实验设计患儿，男性，3岁，因面色苍白伴血尿1天入院。1天前食用新鲜蚕豆后，今日出现恶心、呕吐、排尿呈酱油样色，面色苍白。据家长反映，患者的姐姐也曾发生过类似情况。体格检查：体温38℃，脉搏150次/分，呼吸40次/分，血压80/60mmHg，呼吸急促，神清，萎靡，面色苍白，皮肤及巩膜黄染，体型较同龄人瘦小。心、肺未及异常，肝、脾未触及，双肾区无叩击痛，神经系统检查未及异常。实验室检查：红细胞1.98×1012/L，血红蛋白53g/L，血清总胆红素85.5µmol/L，结合胆红素13.7µmol/L，未结合胆红素71.8µmol/L，尿蛋白（++），潜血(+)，尿胆红素(-)，尿胆素原(+)，尿液镜下未见红细胞。1、根据上述患儿的临床表现和实验室检查，初步判断患儿是何种疾病？（必答）2、请设计实验进一步明确诊断。（必答）要求：实验名称，实验方法，主要试剂和仪器，实验操作流程及注意事项，结果如何分析。3、从生化代谢解释患儿的临床表现和实验室检查结果。（必答）4、要想探讨该病发生的分子基础，可以用哪些技术检测什么目的基因？（选答）5、患者体型瘦小与该病症是否有关，为什么？（选答）该患儿为：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶缺乏症（蚕豆病）患者正常值体温38°C↑37°C脉搏150次/min↑75次/min呼吸40次/min↑12~18次/min血压80/60mmHg↓100~120/60~80mmHg红细胞1.98×1012/L↓6.0~7.012×10/L血红蛋白53g/L↓170~200g/L血清总胆红素85.5µmol/L↑3.4~17.1µmol/L结合胆红素13.7µmol/L↑1.7~6.8µmol/L未结合胆红素71.8µmol/L↑34.2µmol/L尿胆红素（－）尿胆素原（＋）尿蛋白（＋＋）潜血（＋）基本情况：男、3岁、伴血尿、食用新鲜蚕豆后，出现恶心、呕吐、排尿呈酱油样色，面色苍白、低热、血压低、呼吸急促、皮肤及巩膜黄染、患者的姐姐也曾发生过类似情况。初步诊断依据1.患者有进食新鲜蚕豆史2.有家族史3.临床上出现贫血、黄疸、血红蛋白尿、等表现概述：蚕豆病俗称胡豆黄，为G-6-PD缺陷者进食新鲜蚕豆或解除蚕豆花粉后引起的急性溶血性贫血。3岁以下小儿多见，男性明显高于女性。本病在进食蚕豆后，出现贫血、黄疸、尿黄赤等主要临床表现，属中医学中“急黄”、“黄疸”范畴。汉·张仲景在《金匮要略·黄疸病脉并论》中云：“谷气不消，胃气苦浊，清气下流，小便不通，阴被其寒，热流膀胱，身体尽黄，名曰黄疸。”发病机制：磷酸戊糖途径产生↓G-6-PD↓→NADPH+H+→GSH↓→红细胞的抗氧化能力↓→发生溶血遗传方式：X连锁不完全显性遗传子代：XXXXXYXY儿子一定患病，女儿则50%母：XX父：XY母：XX父：XY子代：XXXXXYXY儿子一定正常，女儿则50%母：XX父：XY子代：XXXXXYXY女儿50%机会患病，儿子50%机会携带该基因潜伏期长短不一，多在进食新鲜蚕豆后1~2天内发生溶血，因吸入花粉而发病者出现症状较早最短者仅2小时，早期症状为全身不适，畏寒、低热、头晕、乏力、食欲减低、恶心、呕吐、腹痛，腹泻等。发热一般持续2~3天，严重者可迅速出现重度贫血、巩膜轻度黄染，尿色如浓茶水或酱油水。•严重者可出现全身衰竭、面色极度苍白、血压下降、神智迟钝、甚至昏迷、抽搐，少尿或无尿等急性循环衰竭和急性肾功能衰竭的表现。如抢救不及时可引起死亡，但如能及时抢救，使患者度过急性溶血危险，几天之后病情会很快好转。若要进一步诊断，需进行以下实验1.高铁血红蛋白还原实验2.红细胞G-6-PD活性实验高铁血红蛋白还原实验G6PD缺乏红细胞G6PD活性实验确诊蚕豆病高铁血红蛋白还原实验•原理：在全血中加入亚硝酸钠，使红细胞中的亚铁血红蛋白氧化为高铁血红蛋白（MHb）,高铁血红蛋白在高铁血红蛋白还原酶的作用下又被还原为亚铁血红蛋白。在这过程中，高铁血红蛋白还原酶不仅需要亚甲蓝作为递氢体，还需要由G6PD参与磷酸戊糖途径形成NADPH作为辅酶才完成上述反应。所以，G6PD缺陷症的患者其MHb还原率下降（分光光度技术）主要试剂：0.18mol/L亚硝酸钠-葡萄糖溶液①、0.4mmol/L亚甲蓝溶液②、0.28mol/L葡萄糖溶液③、混合液（等量①+②+③）、生理盐水、抗凝剂仪器：紫外分光光度计水浴箱、离心机、试管3支实验步骤1、取静脉血1.8mL于抗凝管，混匀。抗凝管(含0.2mL109mmol/L抗凝剂+葡萄糖20mg)2、1000r/min离心沉淀15min。调整血细胞与血浆比侧为1：1后再混匀。3、将0.18mol／L亚硝酸钠一0.28mol／L葡萄糖溶液与0.4mmol／L亚甲基蓝溶液等量混合．形成混合试剂。4、取15moL×150mm试管3支，标明A、B、C，按下表顺序进行操作。试剂ABC混合试剂/ml0.01————生理盐水/ml——0.01——0.08mol/L亚硝酸钠-0.28mol/L葡萄糖溶液————0.01经处理的全血0.10.10.1来回摇动15~20次置37°C水浴箱静置3h蒸馏水/ml10.010.01、血细胞比容比值过低，高铁血红蛋白还原率降低。应将血细胞比容调整到0.35-0.402、细菌污染可产生亚硝酸盐而造成假阳性，试管等应无菌3、不稳定Hb、高脂血症等均可出现假阳性结果，故应2h内送检4、标本不应有凝血或溶血，故需使用抗凝管5、在标本内应适当加入葡萄糖，以避免较全血缺乏结果分析方法正常值：MHb还原率=75%，脐血=77%临床诊断：纯合子和半合子（XY）患者：MHb还原率30%脐血40%杂合子患者：MHb还原率31%~74%脐血41%~76%红细胞G6PD活性实验原理：红细胞溶血后的血液中，加入氯化镁、NADP和6-磷酸葡萄糖后，在340nm波长处观察NADPH新生含量的光密度，正常人G6PD活性为5~15U/g血红蛋白或1.5~7.9U/10g红细胞。方法：①WHO推荐的Zinkham;②NBT定量法等主要试剂：生理盐水、溶血素、3.8mmol/LNADP、0.5mol/LTris缓冲液（pH7.5）、0.63mol/L氯化镁溶液、33mmol/LG-6-P液仪器：紫外分光光度计水浴箱、离心机、试管实验步骤G-6-PD活性测定的操作表（Zinkham法)试管对照管测定管NADP液（ml）0.10.1Tris液（ml）0.10.1氯化镁液（ml）0.10.1蒸馏水（ml）0.680.58G6P液（ml）—0.137℃预热溶血液（μl）2020立即340nm处测吸光度，以对照管调零，37℃恒温，每分钟观察1次，记录吸光度的变化计算公式：G-6-PD活性（U/gHb）=△A/min×1000/6.22×1020/20×Hb(gL-1)•△A/min:每min吸光度的平均变化值•1000/6.22:为微摩尔消光系数•1020/20:总容量与溶血液的量之比；实验步骤1、急性溶血期后2~3个月再查或复查G6PD活性2、最好同时作阴性对照和阳性对照（影响因素多）3、离心沉底后应取底层红细胞测定G6PD活性结果分析方法G6PD缺陷者：G6PD活性较正常平均值低40%以上即可作出诊断：WHO推荐的Zinkham（12.01±2.09)IU/gHb(37℃)NBT定量法（13.1~30.0）NBT单位方法正常值范围主要临床表现：1、排尿呈酱油样色，面色苍白2、低热、血压低呼吸急促脉搏快3、面色苍白，皮肤及巩膜黄染4、血清总胆红素↑，结合胆红素变化不大、未结合胆红素↑，尿蛋白（++），潜血(+)，尿胆红素(－)，尿胆素原(+)，血尿、排酱油色尿、面色苍白G6PD↓GSSG(氧化型谷胱甘肽)NADPH+H+NADP+AAH22GSH(还原型谷胱甘肽)→NADPH+H+↓→红细胞的抗氧化能力↓→GSH↓→红细胞膜破裂→溶血性贫血（面色苍白）→游离Hb肾吸收阈值→血红蛋白尿/含铁血黄素尿GSH的主要作用①保护红细胞内的含硫氢基（-SH）血红蛋白、酶蛋白和膜蛋白的完整性，免遭氧化②与谷胱甘肽过氧化酶共同使H2O2还原成H2O体温升高、机理：红细胞破裂↓血红蛋白暴露↓免疫系统攻击（单核-吞噬细胞系统）↓体温升高溶血性贫血↓具有载O2能力的Hb含量下降↓机体缺O2↓呼吸急促呼吸急促血压低、脉搏快红细胞破裂↓血红蛋白渗出→运氧功能障碍↓↓循环血量减少脉搏加快(心率加快）↓血压下降皮肤及巩膜黄染机理：溶血性黄疸尿胆红素(－)、尿胆素原(+)肝肠循环增多胆红素单核吞噬系统降解血红素红细胞破裂血红蛋白渗出尿蛋白(++)过多34.2umol/L时，黄疸①血清总胆红素↑②结合胆红素变化不大（水溶性大，随尿排出）③未结合胆红素↑（水溶性小，不能随尿排出，有毒）要想探讨该病发生的分子基础，可以用哪些技术检测什么目的基因？要想探讨该病发生的分子基础，需要对目的基因进行基因结构分析，即DNA序列检测DNA序列测定方法直接法双脱氧末端终止法（Sanger法）DNA的自动化测序化学裂解法（Maxam-Gilbert法）间接法：对于未知片段，或片段过长，用几种方法（RFLP；PCR-RFLP；SSCP）来粗略的估计待分析基因的一级结构是否与对照基因相同