基因调控-第4次课-翻译后修饰

2013-5-9翻译后修饰研究的方法和技术常见的蛋白质翻译后修饰过程一、蛋白质泛素化修饰研究策略和方法蛋白质降解调控着机体内几乎所有的生命活动，蛋白质在完成功能后，以及在合成、折叠、转运等过程中发生错误或损伤时都必须被降解和清除。细胞中主要存在两类蛋白质降解的途径，一是溶酶体降解途径，二是泛素-蛋白酶体降解系统(ubiquitin-proteasomesystem,UPS)。UPS是真核细胞内ATP依赖的蛋白降解系统，可高度选择并高效降解细胞内的蛋白质。两类蛋白质降解途径泛素蛋白酶体途径(ubiquitinproteasomepathway)泛素蛋白酶体途径介导的蛋白降解是机体调节细胞内蛋白水平与功能的一个重要机制。负责执行这个调控过程的组成成分包括泛素及其启动酶系统和蛋白酶体系统。泛素启动酶系统负责活化泛素，并将其结合到待降解的蛋白上，形成靶蛋白多聚泛素链，即泛素化。蛋白酶体系统可以识别已泛素化的蛋白并将其降解。.泛素化是指泛素分子在一系列特殊的酶作用下，对靶蛋白进行特异性修饰的过程。这些特殊的酶包括泛素激活酶E1，结合酶E2、连结酶E3等。泛素化在蛋白质的定位、代谢、功能、调节和降解中都起着十分重要的作用。同时，它也参与了细胞周期、增殖、凋亡、分化、转移、基因表达、转录调节、信号传递、损伤修复、炎症免疫等几乎一切生命活动的调控。1.抑制剂处理β-actinXMG-132(h):03612Saos-2cellsCβ-actinXLactacystin(h):03612Saos-2cellsD蛋白质泛素化修饰研究策略和方法亚胺环已酮cycloheximide（CHX）MG132(h)06IP:UbIB:XX-(Ub)nXA2.IP实验证明目的蛋白存在泛素化修饰BXMG132(h)06IP:XIB:UbX-(Ub)nA3.鉴定泛素化修饰位点：质谱或生物信息学分析B荧光素酶报告基因实验（1）构建K突变质粒CFlag-hX:HA-ubiquitin:+++++++IP:FlagIB:HA1%Inputβ-actinX-(Ub)n（2）IP验证（1）泛素化修饰位点突变后对蛋白质稳定性的影响4.生物学意义（2）泛素化修饰对目的蛋白反式激活活性的影响BA（3）泛素化修饰对目的蛋白促成骨分化功能的影响二、蛋白质乙酰化修饰研究策略和方法乙酰化是一种可逆且高度调控的蛋白质翻译后修饰，主要发生于蛋白质赖氨酸残基，它调控细胞凋亡、蛋白质亚细胞的定位、DNA和蛋白质相互作用、DNA复制和修复、DNA转录的活性及蛋白质的稳定性等过程。赖氨酸乙酰化最初在组蛋白上被发现(Vidalietal，1968)，但是之后又用了将近30年的时间发现第一个非组蛋白P53上的乙酰化修饰(GuandRoeder，1997)。组蛋白去乙酰化酶(histonedeacetylase,HDAC)组蛋白乙酰化转移酶（histoneacetyltransferase,HAT）1.蛋白质乙酰化修饰的生物学意义核心组蛋白N端的末端富含赖氨酸，生理条件下带正电，它可与带负电的DNA或相邻的核小体发生作用，导致核小体构象紧凑及染色质高度折叠。乙酰化使组蛋白与DNA间的作用减弱，导致染色质构象松散。这种构象有利于转录调节因子的接近，从而可以和转录因子结合，促进基因的转录。去乙酰化则抑制基因转录。（1）去乙酰化酶抑制剂处理2.乙酰化修饰研究策略和技术（2）IP鉴定是否存在乙酰化修饰（3）乙酰化酶的鉴定WesternblotCo-IPCo-IPHA-X-GFPFlag-CBP-HADIPA（4）乙酰化酶和目的蛋白的共定位研究-细胞免疫荧光技术（5）乙酰化位点的鉴定-——构建K点突变质粒通过质谱鉴定或生物信息学分析（6）去乙酰化酶的鉴定（7）去乙酰化酶和目的蛋白的共定位研究-细胞免疫荧光技术（8）乙酰化修饰对目的蛋白功能的影响-蛋白稳定性（9）乙酰化修饰对目的蛋白功能的影响-DNA结合能力EMSALuciferasereporterassay三、蛋白质磷酸化修饰研究策略和方法磷酸化（phosphorylation）：是通过蛋白质磷酸化激酶将ATP的磷酸基转移到蛋白的特定位点上的过程。细胞内至少有30％的蛋白被磷酸化修饰。蛋白质磷酸化可发生在多种氨基酸上，其中以丝氨酸为多，接着是苏氨酸。而酪氨酸则相对较少磷酸化的发生，不过由于经过磷酸化之后的酪氨酸较容易利用抗体来纯化，因此酪氨酸的磷酸化作用位置也较广为了解。它们发生磷酸化的比例是800：200：1蛋白的磷酸化状态的平衡由蛋白激酶和磷酸酶相互影响而维持。磷酸化的蛋白可以被非特异性的磷酸酶（例如：碱性磷酸酶），特异性的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶、酪氨酸蛋白磷酸酶或双重特异性磷酸酶去磷酸化。（1）磷酸酶抑制剂处理PhosStop-磷酸酶抑制剂：可同时持续抑制包括酸性和碱性磷酸酶，及丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶（PP1,PP2A,PP2B）和酪氨酸蛋白磷酸酶在内的多种磷酸酶。蛋白质磷酸化修饰研究策略和方法（2）磷酸化修饰的鉴定（3）磷酸化位点的鉴定——质谱分析和生物信息学分析生物信息学分析（4）激酶的鉴定（5）磷酸化修饰的生物学意义对蛋白稳定性的影响对转录因子反式激活活性的影响Figure2.Schematicillustrationofthefull-lengthhumantypeIRunx2isoform,beginningwiththeN-terminalsequenceMRIPV(NP_004339).