实验室层析填料应用指南

GE医疗中国层析介质应用手册GE生命科学部层析技术应用部多肽的纯化3重组细胞因子的纯化6抗体及抗体片段的纯化9组氨酸标签蛋白的纯化13GST标签蛋白的纯化15MBP&Strep(II)标签蛋白的纯化17膜蛋白的纯化19蛋白复合物的纯化21包涵体柱上复性24TCM的纯化26达替肝素的纯化29疫苗的纯化31寡核苷酸的纯化34质粒DNA的纯化35病毒载体的纯化37流脑多糖的纯化40层析法纯化血浆蛋白41PEG修饰蛋白的纯化45目录合编者：董白敏，樊丰林，刘白静，罗白亮，马志宇，王济源，王奕军，吴宝平，谢博华，解红艳。咨询热线：800-810-9118400-810-9118网址：（按照字母表排序）GE生命科学部层析技术应用部3咨询热线：800-810-9118400-810-9118网址：多肽的纯化简介氨基酸之间可以通过肽键相连，分子量在5000~3000之间的肽称为“大肽”；分子量在3000~1000之间的肽称为“多肽”，分子量在1000~180之间的称为“小肽”、“寡肽”、“低聚肽”，也称为小分子活性多肽。大多数多肽都是化学合成的。更大的肽一般指超过25氨基酸需要通过重组DNA的技术表达生产。自然界中20种氨基酸，按照其取代基团性质差异而呈现不同的酸碱性，疏水性，芳香族或者极性侧链。这些侧链的不同属性可以作为进行层析分离的基础。多肽的紫外吸收通常在206nm-220nm,如果含有芳香族的基团，紫外的吸收最大值会在268nm-280nm检测到。多肽来源分为：天然肽如激素，某些抗生素，人体内的脑啡肽，谷胱甘肽和细菌的毒素都是天然存在的肽；合成多肽如合成胸腺肽，重组多肽如EGF，及蛋白的多肽消化片段。一、多肽纯化技术简介1、反相分离技术（首选技术，小肽常用）：SOURCE骨架的反相层析介质为目前可在中压系统中操作的最小粒径凝胶。与传统的硅胶骨架的反相介质相比，SOURCE介质能在pH1-14稳定工作，并可以用1MNaOH进行清洗再生，高流速低反压，应用范围更广，寿命更长。•SOURCE30RPC适合中度或精细纯化•SOURCE15RPC适合精细纯化•SOURCE5RPC适合分析或精细纯化用Source5RPC在pH9.5条件下分析用胰酶消化的BSA的还原肽图。图1：SOURCERPC颗粒在电子显微镜下的图片。每个颗粒都是大小均匀，绝无碎片和破碎颗粒。System:ÄKTA™purifierSample:RVP-BSA-mT,ca750pmolColumn:SOURCE5RPCST4.6/150EluentA:NH4OH/HCOOH,10mmol/l,pH9.5EluentB:60%acetonitrileineluentAGradient:0–67%Bover115mli.e.46columnvolumes(CV)Flowrate:0.5ml/min图2：在高pH值下进行反相层析分析RVB-BSA-MT的肽图。合成的阿尔茨海默氏病人中发现的淀粉样蛋白-ß1-42肽肽粗产物溶解在125mmol/l,pH13的氢氧化钠溶液中,上柱前再稀释。图3为优选各种方法,其结果表明用pH9.0氨水/甲酸能得到最好的分离。层析介质应用4咨询热线：800-810-9118400-810-9118网址：：不同pH条件下用SOURCE5RPC反相层析柱分析引起老年痴呆症的淀粉样肽。图5：在superdexpeptidePE7.5/300上分离标准蛋白。样品：血管紧张肽Ⅱ和Ⅲ层析柱：SOURCE30RPCHR10-108ml流速：4ml/min图4：在碱性条件下用SOURCERPC分离、检测仅相差一个氨基酸的多个血管紧张肽。2、分子筛技术：是利用多肽分子大小、形状差异来分离纯化多肽物质。Superdexpeptide专门分离多肽类产品的高分辨率分子筛凝胶，分离的分子量范围为100-7000Da。高化学稳定性,pH1-14,兼容有机溶剂(乙腈+TFA)。图6：通过QsepharoseHP将只有一个lysine差异的x-肽和它的前体x-k肽分开。3、离子交换分离技术：当分离的多肽带有电荷的时候，可以选择用离子交换层析进行分离，通常离子交换会和RPC及SEC相结合分离复杂的样品，如酶解多肽片段或者合成多肽，及天然来源的多肽。用于精细分离的离子交换介质，如HP，SOURCE，Mono，Mini等精细介质非常适合多肽的分离。GE生命科学部层析技术应用部5咨询热线：800-810-9118400-810-9118网址：三、不同来源多肽纯化的总结：•用SOURCE骨架的反相介质，可以在更宽的pH进行工艺优化，具有更强的适用性以分离各种肽类。•离子交换技术很适合合成多肽和天然多肽的纯化，特别在粗纯的步骤。•如果反相和离子交换技术都效果不好，原因可能是溶解性的问题。•使用凝胶过滤如Superdexpeptide，SephadexLH20都很好的用在多肽纯化中。•需要增加选择性，载量和稳定性：用多维纯化方法，可以将离子交换，分子筛和反相层析等多种技术结合，而代替一步反相或反复用反相柱子纯化。四、订货信息产品数量货号Superdex30prepgrade1,000–10,00017-0905-01SOURCE5RPCST2.1/150117-5208-01SOURCE5RPCST4.6/150117-5116-01SOURCE15RPCST4.6/100117-5068-01RESOURCE™15RPC1ml17-1181-01RESOURCE15RPC3ml17-1182-01SOURCE15RPC10ml17-0727-20SOURCE30RPC10ml17-5120-20SOURCE30RPC200ml17-5120-02SOURCE15RPC10ml17-0727-20PeptideMarkerKit180-1129-83五、参考文献1.StaffanRenlund.‘PurificationofaphosphorylatedPDGFa-receptorderived.2.peptideathighpHusingapolymerstationaryphase’ABApplicationNote18-1132-63.3.Courtesyofprofessorda-fuCui,InstituteofBiochemistryandCellBiology,CAS.4.ChaoYuetal,PharmaceuticalBiotechnology,19985(2),103-108.5.Q-HHuangetal,PharmaceuticalBiotechnology,20018(4),207-209.6.Detectionandcharacterisationofoligosaccharidesincolumneffluentsusingsurfaceplasmonresonance.FourteenthInternationalSymposiumontheseparationandanalysisofProteins,Peptides,andPolynucleotides,Heidelberg,Germany.(1994).Fägerstam,L.,Blikstad,I.,Bhikhabhai,R.etal.7.thenewgeneartionofpolystyrenedivinylbenzeneReversedPhaseChromatographymedia,18-1132-46.8.Downstream29,P18-19,18-1135-38.9.“ReversedPhaseChromatograph”手册18-1134-16.二、多肽分离技术的综合运用对于大多数的多肽来说，仅仅一步纯化或一种技术应用是不够的，通常会将反相，离子交换和凝胶过滤这三种技术综合起来进行多步纯化，最终达到高的分辨率。例1、PY574a多肽，14aa，pI10,在酸性条件下不溶。纯度:90%SpSepharoseXL粗纯SephadexG10脱盐SOURCE15RPC精纯纯度:99%DEAESepharoseFF粗纯SephadexG10脱盐SOURCE15RPC精纯例2、合成a1胸腺肽MW3108，pI4.2。层析介质应用6咨询热线：800-810-9118400-810-9118网址：重组细胞因子的纯化简介重组细胞因子是利用基因工程技术生产的细胞因子的产品，作为药物用于治疗肿瘤、感染、造血障碍等，可收到良好的疗效。通过基因工程技术和多种层析分离技术表达纯化的高纯度活性细胞因子可以有效促进免疫细胞、干细胞的体外生长，用于细胞治疗等相关研究领域。多种相关新药已经上市。近年出现的动物细胞表达的细胞因子具有完整的糖基化等翻译后修饰，避免蛋白复性，稳定的天然构象使因子比活和长期稳定性有显著改进，逐渐成为技术发展趋势。新型Capto系列层析介质，为来自不同表达系统的多种细胞因子提供高效的生产纯化技术工具，通过对于宿主杂蛋白、DNA以及未糖基化修饰完全的变体和异构体的有效去除，成功得到多种性质均一的活性细胞因子，提高比活性。常见的重组细胞因子有：干扰素（Interferon,IFN）、肿瘤坏死因子（tumornecrosisfactor,TNF）、集落刺激因子（colony-stimulatingfactor）、趋化因子（chemokine）、生长因子（growthfactor,GF）、白细胞介素系列（interleukin,IL)等。一、原核表达细胞因子的纯化工艺1、重组人干扰素α2b(rh-IFNα2b)的纯化：图1：细胞因子的功能。图2：干扰素纯化流程图及电泳检测图谱，纯度可达95%以上,比活达到1.2×108IU/m以上)。Sephacrys-l100rh-IFNα2bDEAESepharoseFF包涵体变性复性大肠杆菌发酵2、肿瘤坏死因子(TNF)纯化工艺：图3：TNF的纯化流程图。Sephacryls-200TNF98%纯度DEAE-SepharoseFF变性取上清液大肠杆菌包涵体表达Sephacryls200图谱：Peak1洗脱峰为目的峰。3、重组人集落刺激因子(rhG-CSF)纯化工艺：图4：rhGCSF的纯化流程图及电泳检测图谱，纯度98%。SephadexG-25脱盐RhG-CSFphenylHP包涵体变性复性大肠杆菌发酵GE生命科学部层析技术应用部7咨询热线：800-810-9118400-810-9118网址：：趋化因子的纯化流程图及层析图。图8：趋化因子的纯化流程图及层析图。4、趋化因子(chemokine)纯化工艺：超滤浓缩SephacrylS-200。趋化因子NiSepharoseFF菌体破碎收集上清大肠杆菌发酵Ni亲和层析图谱：500mmol/Limidazole洗脱1、分子量Marker2、293细胞培养上清3、CaptoDEAE洗脱4、Captophenyl洗脱二、动物细胞表达细胞因子纯化工艺相比细菌原核表达的细胞因子而言，哺乳动物细胞，如HEK293人细胞表达过程中避免了包涵体形成和复性，天然的正确折叠构象和翻译后修饰有利于提高比活性。GEHealthcare可以提供多种层析分离技术，用于高纯度细胞因子的纯化、生产和分析。1、重组人肿瘤坏死因子(TNFa)纯化工艺：图6：HEK293表达TNFa纯化流程图。图7：Captophenyl精纯层析图谱(红色部分为活性组分)。Captophenyl疏水层析TNF98%纯度CaptoDEAE阴离子交换离心过滤澄清HEK293细胞化学界定无血请培养Capto系列疏水层析介质提高载量的同时，通过改进传质效果进一步减小洗脱峰宽