生物质谱分析

生物分析技术第5讲生物质谱分析2011年10月第一节概述第二节质谱仪第三节生物质谱的应用主要内容质谱分析法(MassSpectroscope,MS)是将化合物形成离子或碎片离子，按质荷比(m/z)的不同进行测定，从而进行成分分析和结构分析的一种方法。根据质谱分析法的结果（质谱图）所提供的信息可以进行有机物、无机物的定性和定量分析，生物大分子的结构分析，同位素的测定及固体表面的结构和组成分析。生物质谱就是用于生物分子分析的质谱技术。由于生物分子大多数以其高相对分子质量区别于分子质量在几十到几千的无机或有机小分子，因而，生物质谱要求测定上万甚至几十万的分子质量。第一节概述早期，质谱分析法仅限于小分子和中等分子的研究，因为要将质谱应用于生物大分子需要将其制备成气相带电分子，然后在真空中物理分解成离子。如何使蛋白分子经受住离子化过程而又不丧失其结构形态是个难题。20世纪70年代，解吸技术的出现成功地将蛋白分子转化成气相离子，而后快原子轰击与其紧密相关的溶液基质使得具有极性、热不稳定的蛋白分子可经受住电离过程。但这些方法仅限于10kD以下蛋白分子的研究。80年代电喷雾电离(ESI)和基质辅助激光解吸电离(MAILDI)技术的发展则使得质谱方法成功应用于高分子量蛋白分子的研究。1906年J.JThomson在实验中发现带电荷离子在电磁场中的运动轨迹与它的质荷比有关并于1912年制造出第一台质谱仪1946年飞行时间质量分析器1953年四极杆质量分析器1959年质谱仪首次用于多肽测序1965年离子共振质谱1968年电喷雾离子源1974年傅里叶变换离子回旋共振分析器1987年基质辅助激光解吸电离质谱质谱仪的发展历史日本科学家田中耕一(KoichiTanaka)1959年出生于日本富山县首府富山市，1983年获日本东北大学学士学位，现任职于京都市岛津制作所，为该公司研发工程师，分析测量事业部生命科学商务中心、生命科学研究所主任。他对化学的贡献类似于约翰·芬恩，因此也得到了1／4的奖金。美国科学家约翰·芬恩1917年出生于美国纽约市，1940年获耶鲁大学化学博士学位，1967年到1987年间任该大学教授，1987年起被聘为该大学名誉教授，自1994年起任弗吉尼亚联邦大学教授。他因为“发明了对生物大分子进行确认和结构分析的方法”和“发明了对生物大分子的质谱分析法”而获得今年诺贝尔化学奖1／4的奖金。瑞士科学家库尔特·维特里希1938年生于瑞士阿尔贝格，1964年获瑞士巴塞尔大学无机化学博士学位，从1980年起担任瑞士苏黎世联邦高等理工学校的分子生物物理学教授，还任美国加利福尼亚州拉霍亚市斯克里普斯研究所客座教授。他因“发明了利用核磁共振技术测定溶液中生物大分子三维结构的方法”而获得2002年诺贝尔化学奖一半的奖金。2002年诺贝尔化学奖获得者第二节质谱仪一、质谱仪的工作原理二、质谱仪的基本结构1.真空系统2.进样系统3.离子源4.质量分析器5.检测与记录离子源质量过滤/分析器样品板LC或GCEI源FAB源MALDI源ESI源QuadruopoleIontrapTime-of-flight电子倍增器闪烁计数器+++++++++++++++++++++++++++++++++++++一、质谱仪的工作原理样品导入系统检测器zU=(1/2)m2m/z=2U/2化合物分子在高真空条件下，受高速电子流“轰击”或强电场其他作用，失去电子生成离子或发生化学键断裂成为碎片离子，离子经加速器进入磁场，其动能与加速电压及电荷遵循：具有速度的带电离子进入质谱分析器的电磁场中，根据所选择的分离方式，最终各种离子按质荷比的不同实现分离。质谱仪的分类二、质谱仪的基本结构质谱仪的构造和功能计算机控制与数据处理1.真空系统2.进样系统3.离子源4.质量分析器5.检测与记录•质谱仪的离子源、质量分析器和检测器必须在高真空状态下工作，一般应在10-5～10-6Pa。(1)真空度差，过多的氧气将损耗或烧毁离子源的灯丝；(2)高本低气压将干扰质谱图;(3)电离空气压过高，会发生离子-分子反应，改变碎片谱图；(4)离子源内的高气压将干扰电子束的调节；(5)电离气或离子源内的高气压，可能引起高达数千伏的离子加速电压放电。1.真空系统•一般质谱仪由机械真空泵(低真空泵)，扩散泵或分子泵(高真空泵)组成真空机组，使离子源和分析器部分的达到真空。•只有在足够高的真空下，离子才能从离子源到达接收器，真空度不够则灵敏度低。2.进样系统要求：高效重复的将样品引入到离子源中并且不能造成真空度的降低，而样品导入离子源的方式决定于样品的物理性质。方式：(1)间歇式进样系统(2)直接探针进样(3)毛细管进样（从HPLC、GC及CE）(1)间歇式进样系统可用于气体、液体和中等蒸汽压的固体样品进样，通过可拆卸式的试样管将少量固体或液体试样引入试样储存器中。由于进样系统的低压强及储存器的加热装置，使试样保持气态。加之进样系统的压强比离子源的压强大，样品分子或离子可以通过分子漏隙以分子流的形式渗透进高真空的离子源。(2)直接探针进样通常将试样放入小杯中，通过真空闭锁装置将其引入离子源，可以对样品杯进行冷却或加热处理。对于在间歇式进样系统的条件下无法变成气体的固体、热敏性固体及非挥发性液体试样，可直接引入到离子源。这种进样方式不必使样品充满整个储存器，因此，可适用样品量较小和蒸汽压较低的物质。直接进样法扩大了质谱法的应用范围。(3)毛细管进样气相色谱-质谱联用仪从毛细管气相色谱柱流出的成分可直接引入质谱仪的离子化室。液相色谱-质谱联用仪采用离子喷雾及电喷雾技术除去流动相使样品离子进入质谱分析仪。质谱仪中产生离子的装置称为离子源，其功能是将进样系统引入的气态样品分子转化成离子。不同的分子离子化所需要的能量不同，因此，应选择不同的离解方式：硬电离：能给予样品较大能量的电离方法。软电离：给予较小能量的电离方法，适用于易破裂或易电离的样品。3.离子源(1)电子轰击电离源(ElectronImpactIonization,简称EI):样品需经过汽化进入电离区，用约70eV能量的电子束与气化的试样分子相互作用，使分子中电离电位较低的价电子或非键电子电离，为硬电离方法。1980年以前的主要离子化方式，只能用于有机小分子(400Da以下)的电离。质谱技术中的离子源电子轰击电离的优缺点优点①灵敏度高；②有达10万个化合物的数据库可快速检索；③可根据碎片方式鉴定未知物；④从碎片离子判定结构。缺点①质量范围小；②有可能汽化前发生解离；③碎片过多有时看不到分子离子。质谱技术中的离子源(2)化学电离源(ChemicalIonization,简称CI):高能电子束与小分子反应气（如甲烷、丙烷等）作用，使其电离生成初级离子，这些初级离子在与试样分子反应得到试样离子，核心是质子转移。(3)场电离(FieldIonization,简称FI):在相距很近的电极间施加高电压，产生强电场，依靠这个强电场将附近的试样分子中的电子拉出来，使之形成离子。质谱技术中的离子源(4)快原子轰击源(FastAtomBombardment，简称FAB):20世纪80年代发展起来的新离子化方法，是让稀有气体（氙气或氩气）电离，通过电场加速，获得较高动能成为快原子，然后轰击试样分子，通过能量的转移，使试样分子电离。快原子轰击技术优点：①分子离子和准分子离子峰强；②碎片离子峰丰富；③灵敏度高，适用于热不稳定、极性强的分子，如肽类、蛋白质、多糖、金属有机物等。快原子轰击技术缺点：试样涂在金属板上，溶剂也被电离，使质谱图复杂化。质谱技术中的离子源(5)大气压化学电离源(AtmosphericPressureChemicalIonization，简称APCI):主要用于液相色谱-质谱联用仪，主要用来分析中等极性、弱极性化合物。APCI主要产生单电荷离子，分析化合物的相对分子质量一般小于1000.APCI主要部件是一个双层套管组成的电喷雾的喷嘴，喷嘴内层是液相色谱流出物，外层是雾化气，通常为大流量的N2，其作用是使喷出的液体分散成微滴。在喷嘴的下游有一个针状放电电极，通过放电电极的高压放电，使空气中某些中性分子电离，产生H3O+,N2+,O2+等离子，这些离子与分析物分子进行离子-分子反应，使分析物分子离子化。(6)电喷雾电离(ElectrosprayIonization，简称ESI):是一种使用强静电场的电离技术。它主要应用于液相色谱-质谱联用仪或毛细管电泳-质谱联用仪，既作为色谱和质谱之间的接口装置，同时又是电离装置。质谱技术中的离子源电喷雾电离是在“离子蒸发”的原理基础上发展起来的一种离子化方法。待测分子溶解在溶剂中，以液相方式通过毛细管到达喷口，在喷口高电压作用下形成带电荷的微滴，随着微滴中的挥发性溶剂蒸发，微滴表面的电荷体密度随微滴半径的减少而增加，到达某一临界点时，样品将以离子方式从液滴表面蒸发，进入气相，即实现了样品的离子化，由于没有直接的外界能量作用于分子，因此，对分子结构破坏较少，是一种典型的软电离方式。电喷雾电离最大特点是容易形成多电荷离子，因此，在较小的m/z范围内可以检测到大分子质量的分子。电喷雾质谱目前可测定分子质量在100.000Da以下的蛋白质，最高达150.000Da。适宜相对分子质量大、稳定性差的化合物，如极性强的大分子有机化合物，蛋白质、肽、糖等。除分析大分子外，电喷雾质谱也可分析小分子，对于分子量在1000Da以下的小分子，也可得到物质的分子质量。影响电喷雾电离的因素：①样品的pKa和溶液的pH样品离子取决于样品在喷雾溶液中是否形成离子，正离子检测中，溶液pH应较低，负离子检测，溶液pH应较高。②溶剂的性质用于电喷雾电离的溶剂应能使样品在溶液中形成离子，既有较低的溶剂化能力以利于离子蒸发，具有较低的黏度和表面张力以利于雾化以及具有较低热容量以利于溶剂化。电喷雾电离优缺点优点①测定分子质量高；②灵敏度极高（10-15mol）；③软电离，可观察生物分子非共价反应；④易于和LC串联，直接分析流速为1ml/min的LC洗脱液；⑤没有基质干扰；⑥适于四极杆质量分析器、离子阱质量分析器做结构分析；⑦带多电荷，允许质量范围窄的设备检测高质量数的离子，通过计算平均值给出更精确的质量数；⑧特别适于测多肽的修饰；⑨样品前处理简单可直接分析RP-HPLC脱盐处理的溶液。电喷雾电离优缺点缺点①耐盐能力低；②对某些化合物特别敏感，污染难清洗；③样品需先气化；④带多电荷，在分析混合物时，产生混乱；⑤定量时需内校准。电喷雾与大气压化学电离的比较电离机理：电喷雾采用离子蒸发，而APCI电离是高压放电发生了质子转移而生成[M＋H]+或[M-H]-离子。样品流速：APCI源可从0.2到2ml／min；而电喷雾源允许流量相对较小,一般为0.2-1ml／min.断裂程度；APCI源的探头处于高温，对热不稳定的化合物就足以使其分解.适用性：通常认为电喷雾有利于分析极性大的小分子和生物大分子及其它分子量大的化合物，而APCI更适合于分析极性较小的化合物。多电荷：APCI源不能生成一系列多电荷离子(7)基质辅助激光解吸离子化(MatrixAssistedLaserDesorption，简称MALDI):是近20年发展起来的离子化技术，特别适用于蛋白质、多肽、寡核苷酸等生物大分子的离子化。通常用飞行时间检测器作为质量分析器，构成基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱。可用于生物大分子物质分子量的测定；蛋白质高通量鉴定；有机小分子化合物分子量测定；寡核苷酸的分析；基因的单核苷酸多态性的分析等。质谱技术中的离子源基质辅助激光解吸电离工作原理基质辅助激光解吸离子化引入了固体基质，使样品液与基质液混合，滴于靶面，在真空中快速干燥，制成极细的混晶。当激光束照射在涂有样品和基质混晶的靶面上时，基质的有机分子在固态混晶中共振吸收能量，并将能量传递到基质有机物晶体的晶格中，使晶格受到瞬时强烈扰动而解吸出离子或中性分子，并通过这些离子或分子将吸收的能量传递给生物大分子而使其电离。基质辅助激光