【生物工程】下游技术实验报告

精品文档1华南师范大学实验报告学生姓名：黎嘉俊学号：20102500008专业：生物工程年级、班级：10工程一班课程名称：生物工程下游技术实验实验项目：黑曲霉β-D甘露聚糖酶的纯化实验类型：□验证□设计□综合实验时间：2013年9月17日实验指导老师：江学文实验评分：一．实验目的1、粗酶的制备2、硫酸铵分级沉淀3、透析袋的处理方法和使用二．原理1、盐析原理：中性盐浓度增高到一定数值时，使水活度降低，进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和，水化层逐渐被破坏，最终引起蛋白质分子间相互聚集并从溶液中析出。2、透析袋脱盐：酸性β-甘露聚糖相对分子质量为39000和40000，选择MWCO（切割分子量或截留分子量）14000的透析袋，透过掉分子量小于1000的蛋白质；并借助分子扩散脱盐。三．实验试剂和器材纱布1卷、脱脂棉1包、琼脂条1包、透析袋MWCO（分子量）7000四．实验步骤1、将黑曲霉ASP.Niger菌株斜面接种三角瓶固体发酵培养基,30.5℃恒温培养72h。2、称取10克发酵麸曲，加100毫升pH5.6的醋酸缓冲液，温度35.2℃，转速135rpm，摇床摇60min后，用￠15㎝滤纸过滤。精品文档23、取滤液40毫升，在不断搅拌下分步加入（NH4）2SO422.0克（待加入部分溶解后再加入剩余部分）。4、置冰箱中5℃下静止沉淀过夜。5、标准曲线的绘制：分别吸取0.1%标准甘露糖溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0ml，分别定容至50ml。再分别吸取上述溶液各2.5ml于试管中各加2.5ml3,5-二硝基水杨酸显色液（DNS试剂），煮沸5min（另作1管对照，取2.5ml蒸馏水，加2.5mlDNS试剂，同样煮沸5min）。冷却后，用721型分光光度计在530nm波长下比色，记录各管的光密度值，以光密度作纵坐标，对应标准葡萄糖溶液含糖的毫克数为横坐标，绘制标准曲线。五．实验结果0.1%标准甘露糖溶液体积/ml0246810OD100.0970.4150.8731.2541.674OD200.0970.4160.8731.2561.674OD300.0970.4150.8741.2561.674OD平均值00.0970.4153330.8733331.2553331.674OD标准差000.0005770.0005770.0011550六．分析与讨论（1）本次实验的第一步是标准曲线的制作，在使用分光光度计测定OD值时发现，加入的0.1%标准甘露糖溶液体积为10ml的比色管的试样测出的OD值略大，正常精品文档3来说OD值若大于1.5时虽进行稀释否则误差较大。据分析多组的数据显示装有10ml的试样测出的OD值多数超过1.5，可能是试样浓度太大引起，但超出范围较小，在可以接受的范围内，而且曲线的上升趋势仍然正常，没有出现较大程度的偏离，相关系数为0.952，而且图中个点的位置都在标准曲线的附近并没有偏离太多，均匀分布在曲线的两端，结果比较理想，因而该曲线符合实验的要求。（2）本实验的第二步为转速135rpm，摇床摇60min后，用￠15㎝滤纸过滤，耗时较长而且效果不太好，可以采用高速离心，转速8000rpm，10min，溶液分层明显，然后直接用滤纸过滤仍然有较好效果，且耗时短，过滤时如遇到过滤较难的情况，可以更换滤纸继续操作。（3）实验的第三步是取滤液40毫升，在不断搅拌下分步加入（NH4）2SO422.0克，待加入部分溶解后再加入剩余部分，否则不能沉淀出绝大多数的蛋白质，影响实验的结果，造成误差。七．思考题1、（NH4）2SO4沉淀蛋白质的原理是盐析，与其它盐相比其优点有那些？答：在溶液中加入中性盐使生物大分子沉淀析出的过程称为“盐析”。除了蛋白质和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用盐析法进行沉淀分离。盐析法应用最广的还是在蛋白质领域，已有八十多年的历史，其突出的优点是：①成本低，不需要特别昂贵的设备。②操作简单、安全。③对许多生物活性物质具有稳定作用。中性盐沉淀蛋白质的基本原理：蛋白质和酶均易溶于水，因为该分子的－COOH、－NH2和－OH都是亲水基团，这些基团与极性水分子相互作用形成水化层，包围于蛋白质分子周围形成1nm～100nm颗粒的亲水胶体，削弱了蛋白质分子之间的作用力，蛋白质分子表面极性基团越多，水化层越厚，蛋白质分子与溶剂分子之间的亲和力越大，因而溶解度也越大。亲水胶体在水中的稳定因素有两个：即电荷和水膜。因为中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所以加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。常用的中性盐中最重要的是（NH4）2SO4，因为它与其他常用盐类相比有十分突出的优点：1)溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这是其他盐类所不具备的。由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而盐析操作也要求在低温下（0～4℃）进行。由下表可以看到，硫铵在0℃时的溶解度，远远高于其它盐类。2)分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵盐析，一步就可以除去75％的杂蛋白，纯度提高了四倍。精品文档43)不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的作用。有的酶或蛋白质用2～3mol/L浓度的（NH4）2SO4保存可达数年之久。4)价格便宜，废液不污染环境。2、影响盐析的因素有那些？答：盐析的影响因素①蛋白质的浓度：中性盐沉淀蛋白质时，溶液中蛋白质的实际浓度对分离的效果有较大的影响。通常高浓度的蛋白质用稍低的硫酸铵饱和度即可将其沉淀下来，但若蛋白质浓度过高，则易产生各种蛋白质的共沉淀作用，除杂蛋白的效果会明显下降。对低浓度的蛋白质，要使用更大的硫酸铵饱和度，但共沉淀作用小，分离纯化效果较好，但回收率会降低。通常认为比较适中的蛋白质浓度是2.5％～3.0％，相当25mg/mL～30mg/mL。②pH值对盐析的影响：蛋白质所带净电荷越多，它的溶解度就越大。改变pH值可改变蛋白质的带电性质，因而就改变了蛋白质的溶解度。远离等电点处溶解度大，在等电点处溶解度小，因此用中性盐沉淀蛋白质时，pH值常选在该蛋白质的等电点附近。③温度的影响：温度是影响溶解度的重要因素，对于多数无机盐和小分子有机物，温度升高溶解度加大，但对于蛋白质、酶和多肽等生物大分子，在高离子强度溶液中，温度升高，它们的溶解度反而减小。在低离子强度溶液或纯水中蛋白质的溶解度大多数还是随浓度升高而增加的。在一般情况下，对蛋白质盐析的温度要求不严格，可在室温下进行，但对于某些对温度敏感的酶，要求在0℃～4℃下操作，以避免活力丧失。精品文档5华南师范大学实验报告学生姓名：黎嘉俊学号：20102500008专业：生物工程年级、班级：10工程一班课程名称：生物工程下游技术实验实验项目：盐析β-D甘露聚糖酶活力测定实验类型：□验证□设计□综合实验时间：2013年9月24日实验指导老师：江学文实验评分：一．实验目的1、掌握β-D甘露聚糖水解各种甘露聚糖之间β糖苷键的机制和理论。。2、掌握以魔芋精粉为底物测定发酵制品中β-D甘露聚糖活力的操作方法。二．基本原理水解含B一1，4甘露糖苷键的甘露多糖(包括甘露聚糖、半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖等)的内切水解酶，属于半纤维素酶类。B一甘露聚糖酶能将广泛存在于豆类籽实中的甘露聚糖降解为甘露低聚糖，不仅消除了甘露聚糖对单胃动物的抗营养作用，同时生成的甘露低聚糖在动物肠道中起着重要的调节作用。三、实验试剂和器材721型分光光度计、恒温水浴锅、秒表。pH5.6的醋酸缓冲液四、实验步骤1、倾去部分上清液，立即将沉淀部分在4000rpm，离心10min。收集沉淀，加约20毫升蒸馏水溶解，倒入事先准备好的透析袋中。（透析袋处理：剪成15㎝长度，沸水浴中煮10min，捞起、扯开，在一端1㎝处用细绳扎紧口，用水试一下是否有漏，若有漏需重新绑扎，直至不漏为止。处理过程中需戴手套！）2、酶液倒入透析袋后，另一端1㎝处也用细绳（应用长一点的！）扎紧口，浸于4～5℃的蒸馏水中（250ml烧杯），持续时间1.0h，并不时搅拌，期间每隔精品文档620min更换1次4～5℃的新鲜蒸馏水，以利迅速达到平衡，每次用水量约150毫升。注：1、上端口切不可浸于水中，以免水进入袋中胀破透析袋！2、透析同时可准备2支50ml的比色管，各加0.25g魔芋精粉，加25mlpH5.6的醋酸缓冲液溶解。操作顺序：先量取25mlpH5.6的醋酸缓冲液加入比色管，在55℃水浴预热，再分次、少量将0.25g魔芋精粉加入，待先加的溶解后再加剩下的！溶解完毕，将2支溶有魔芋精粉的50ml比色管始终置于55℃水浴中预热，等待酶解。3、将透析好的酶液透析袋置于玻璃漏斗上，解开上端口细绳或剪去上端口一部分，但不要使酶液流出！）。4、2支溶有魔芋精粉的50ml比色管，1支加透析好的酶液2ml；另1支加灭活的透析酶液2ml（用做对照），55℃水浴下反应10min，取出，立即进行下面操作：事先准备2支50ml的比色管，1支加4.5mlDNS试剂，立即加1.5ml酶解反应液；另1支加4.5mlDNS试剂，立即加1.5ml对照管的酶解反应液，2管同时沸水浴5min后，定容至10ml,于530nm处测定光吸收值。在本实验条件下,定义每10min产生1mg还原糖的酶量为一个单位。（酶液灭活：取5毫升透析酶液置于10ml的比色管，沸水浴15min。）五、实验结果精品文档7计算β-D甘露聚糖酶活力252011.54227/2520BnBgmln酶活力(u/g湿基）)=所测吸光度值在标准曲线上的葡萄糖；测吸光度时比色管定容体积，ml；溶解沉淀的体积,ml；2-水解消耗的酶液体积；反应液稀释倍数；4-与盐析沉淀的滤液量相当的曲料量，g（湿基）样本OD值-样本空白OD值OD12.523OD22.519OD32.524OD平均值2.522OD标准差0.002645751∵Y=（样本OD值-样本空白OD值）=2.522精品文档8∴Y=0.1544x→x=Y/0.1544=2.522/0.1544≈16.33ml又∵0.1%标准甘露糖溶液浓度为1mg/ml∴酶活力（u/g湿基）=×又∵反应液的稀释倍数n=20/(2/6×1.5)=40B=16.33ml×1mg/ml×103=16330∴酶活力（u/g湿基）=×=16330×10×20×40/（2×1.5/27）×1/4≈2.9394×108u/g六、分析与讨论(1)本次实验是基于第一次实验的标准曲线的基础上进行的，在测量OD值的时候不需要用第一次实验的空白对照，因为测量出来的样本OD和样本空白OD相减能消去空白OD的值，因而可以把样本空白OD作为对照，调零操作，直接能显示样本OD减去样本空白OD的结果作为实验的结果。本次实验测量的结果偏大，有第一台仪器测量能达到4.0，另一台仪器的结果比较合适，为2.520左右，但仍比正常的数值偏大很多，数值不在实验第一步得出的标准曲线上，不在标准曲线的适用范围内的数值的话，带入得出的公式误差会很大。通常测量的OD值取用范围在1.8以内，超过该数值误差比较大，若要再进行实验最好进行稀释，测量得出的OD值再乘以稀释倍数。若直接取用本次的较大的测量数据也能带进公式求出，不过误差较大。(2)本次实验测量的OD值偏大，经过观察发现比色杯里面有絮状悬浮杂质，而且液体的颜色明显偏深，进行实验之前其实最好进行过滤再进行OD值的测量。而且实验的各组出现的情况也相同，都是OD值偏大，都能上到4.0，可能实验用的酶液的原料也不纯，有杂质等原因。(3)实验的第二步，酶液倒入透析袋后，浸于4～5℃的蒸馏水中（250ml烧杯），精品文档9持续时间1.0h，并不时搅拌，期间每隔20min更换1次4～5℃的新鲜蒸馏水，以利迅速达到平衡，因为酶液的处理条件比较温和，尽量在低温条件下处理，以免酶失活。而且透析的过程中要不断搅拌，这样可以加快铵根离子的排除，减少后面实验结果的误差，也能缩短实验时间。但是操作的时候要注意，要封好透析袋的两个口，不能让外面的水进去，否则会引起较大的误差。七、思考题1、