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NorthernBlotformicroRNA3MicroRNA简介MiRNA的检测方法•northernblot流程1.RNA的提取2.聚丙烯酰胺胶分离RNA3.RNA转膜4.RNA探针制备5.Northern印记杂交6.显色步骤1miRNeasyMiniKit(QIAGEN,Inc)TRIzoltotalRNAisolation1.RNA的提取2.聚丙烯酰胺胶分离RNA3.RNA转膜4.RNA探针制备5.Northern印记杂交6.显色OD(opticaldensity)OD260OD280OD230OD260/OD280:1.8-2.0OD260/2302.0步骤110ugRNA+2XloadingbufferIncubatedat65℃for10min.Onicefor1min.AcrylamideGel步骤21.RNA的提取2.聚丙烯酰胺胶分离RNA3.RNA转膜4.RNA探针制备5.Northern印记杂交6.显色（1）配制15%的尿素变性PAGE胶，先用0.5XTBE，60V预跑30min。（2）将样品与RNAloadingbuffer按比例混合，70℃预热5min，立即放置冰上。（3）上样前，用缓冲液冲洗点样孔，防止点样孔中的杂质影响电泳。（4）点样时，使样品均匀铺在点样孔底部或者使用微量进样器直接在靠近点样孔底部的位置点样。（5）冰浴中，恒压60-80V电泳约1.5h，至溴酚蓝指示带距底部约3cm处。步骤2（1）电泳结束后，取出凝胶，浸入预冷的0.5XTBE缓冲液中。（2）转膜所用的膜以及滤纸也需用0.5XTBE缓冲液浸湿。（3）组装“三明治”，从负极到正极依次为：滤纸、胶、膜、滤纸。（4）组装转膜装置，确保装置所有正负极都连接正确。（5）冰浴中，恒压60V转膜约1h。步骤31.RNA的提取2.聚丙烯酰胺胶分离RNA3.RNA转膜4.RNA探针制备5.Northern印记杂交6.显色DIGHighPrimeDNALabelingandDetectionStarterKitII1.RNA的提取2.聚丙烯酰胺胶分离RNA3.RNA转膜4.RNA探针制备5.Northern印记杂交6.显色步骤4（1）转膜后，用紫外交联仪固定膜，42℃干燥15min。（2）加入4ml预热的预杂交液，42℃旋转30min。（3）倒掉DIGeasyhyb，加入含探针杂交液（探针用预杂交液稀释至25ng/ml）。（4）在39-42℃温度下，杂交过夜。（5）杂交后的膜在室温用washingbuffer漂洗2遍。步骤51.RNA的提取2.聚丙烯酰胺胶分离RNA3.RNA转膜4.RNA探针制备5.Northern印记杂交6.显色1.杂交后的膜用10mlwashingbuffer在室温漂洗膜。2.用10mlblockingsolution进行室温封闭1h。3.用10mlantibodysolution进行室温孵育2h。4.10mlwashingbuffer漂洗膜次，每次5min。5.再用ECL显色法显色。步骤61.RNA的提取2.聚丙烯酰胺胶分离RNA3.RNA转膜4.RNA探针制备5.Northern印记杂交6.显色