兽用生物制品研发与申报培训

兽用生物制品研发与申报培训根据中监所培训资料改编培训目录一、菌（毒）种种子批建立试验二、实验室安全试验三、实验室效力试验四、诊断制品试验研究五、相关法律法规一、菌（毒）种种子批建立试验原始种子种子批分为三级基础种子生产种子1原始种子比较难界定，没有一个确切的模式。灭活疫苗的原始种子应该是从动物体内分离、纯化、适应、鉴定的培养物，或朋友馈赠的经过一定的工作确定用来制苗的最早培养物为原始种子。如：AIV（H9亚型）灭活疫苗，从病死鸡气管黏液用PBS制成悬液、离心取上清加双抗、接种鸡胚分离病毒，经鉴定后即为原始种子。2种子批定义原始种子定义原始种子具有一定数量背景明确组成均一系统鉴定免疫原性良好系统鉴定繁殖特性良好系统鉴定生物学特性明确系统鉴定鉴别特征明确系统鉴定纯净的菌（毒）株基础种子批定义基础种子由原始种子制备处于规定代次水平一定数量组成均一系统鉴定符合有关规定活的培养物生产种子批定义生产种子由基础种子制备处于规定代次范围内系统鉴定符合有关规定活的培养物3种子批的建立原始种子批的建立种子批建立原则是对选定的菌（毒）株进行纯培养，并将培养物分成一定的数量、装量和成分一致的小包装，于液氮中或其他适宜条件下保存。细菌类种子批应对原始种子进行形态和生化特性、培养特性、血清学鉴定、安全性（活疫苗）或毒力（灭活疫苗）、免疫原性、纯粹等鉴定。病毒类种子批应对原始种子进行病毒含量、安全性（活疫苗）或毒力（灭活疫苗）、免疫原性、特异性以及纯净（细菌、支原体或外源病毒）等鉴定。基础种子批建立基础种子由原始种子经适当方式传代扩增而来，增殖到一定数量后，将相同代次的所有培养物均匀混合成一批，定量分装，保存于液氮中或其他适宜条件下备用。按照规定项目和方法进行系统鉴定合格后，方可作为基础种子使用。基础种子批应达到足够的规模，以便能够保证相当长时间内生产的需要。基础种子代次的确定：通常情况下，将基础种子传代至规定最高代次以上第3代，取不同代次水平的培养物进行含量、免疫原性试验，考察其繁殖特性和免疫原性的稳定性。必要时，还须考察基础种子的遗传稳定性。生产种子批的建立生产种子由基础种子经适当方式传代扩增而来，达到一定数量后，均匀混合，定量分装，保存于液氮中或其他适宜条件下备用。根据特定生产种子批的检验标准逐项（一般应包括纯净性检验、特异性检验和含量测定等）进行检验，合格后方可用于生产。并须确定生产种子在特定保存条件下的保存期。生产种子批应达到一定规模，并含有足量活病毒（或细菌），以确保能满足生产一批或一个亚批产品。4基础种子的鉴定基础种子鉴定生物学特性鉴定含量鉴定安全或毒力试验免疫原性试验免疫抑制试验毒力返强试验鉴别检验或特异性鉴定纯净性检验稳定性试验（1）生物学特性鉴定细菌、支原体类：形态和培养特性、生化特性、血清学特性。病毒类：血清学特性。（2）含量测定应尽量采用通行方法，并应确保在全部试验过程中采用相同的测定指标：半数感染量ID50半数鸡胚感染量EID50半数致死量LD50半数鸡胚致死量ELD50半数细胞培养物感染量TCID50最小感染量MID最小致死量MLD病毒蚀斑形成单位PFU荧光病灶单位FFU菌落形成单位CFU支原体变色单位CCU（3）安全或毒力试验安全性或毒力试验：主要考察基础种子对靶动物的致病性（灭活疫苗）和安全性（活疫苗），为制定相应标准提供依据并为今后的生产和检验过程中应采取的安全措施提供依据。活疫苗安全性试验：包括用多大的剂量对敏感日龄的靶动物或实验动物是安全的。灭活疫苗毒力试验：同样包括用多大的剂量对敏感日龄的靶动物或实验动物能致死或发病或流产。基因工程类活疫苗应按照《农业转基因生物安全管理条例》和《农业转基因生物安全评价管理办法》有关规定进行安全性或稳定性试验，基因工程类灭活疫苗可以同时申报。（4）免疫原性（或最小免疫剂量）试验基础种子免疫原性测定：应分别用基础种子的最低代次和最高代次进行最小免疫剂量测定，以便决定基础种子的使用代次。当然也包括基础种子的最低代次和最高代次的生物学特性、含量、纯净及特异性鉴定。最小免疫剂量试验：用最高代次基础种子，用不同剂量的菌（毒）种分别接种不同组别的靶动物；在接种后的适宜时间分别进行攻毒，以最小的剂量获得有效保护（90%）就是该菌（毒）株的最小免疫剂量。也可不攻毒，在接种后适宜时间分别采血测定抗体效价来测定最小免疫剂量。但前提是该方法已经证明与免疫攻毒方法具有平行关系。血清学效力检验与靶动物免疫攻毒保护相关性的研究采用平行关系试验证明血清学方法的合理性，并为建立判定标准提供依据。常用于成品的效力检验中。具体试验方法：用不同剂量的疫苗免疫接种动物，以便获得不同抗体水平的动物，根据抗体水平的高低，将动物分成若干组，用已经选定的强毒株按照预定剂量进行攻毒，对抗体水平与攻毒保护率之间的关系进行分析。针对多种动物、多种接种途径、各靶动物、各使用日龄都应进行免疫原性（或最小免疫剂量）试验。针对多个血清型的疫苗应进行交叉保护试验。不同地区的流行毒株交叉保护试验（如AIV）。（5）免疫抑制试验（可能不适用）有些病原（如PRRSV、IBDV、REV等）可使动物的免疫系统造成损害，对该类病的生物制品还应进行免疫抑制试验，评估其制品是否存在免疫抑制现象。禽用疫苗评估一般采用ND疫苗。猪用疫苗评估一般采用CSF疫苗。血清学检测或攻击强毒，观察保护率，同时也要观察组织学病理变化，分析是否有免疫抑制。（6）毒力返强试验（可能不适用）先进行预试验，摸索出该种子接种后含毒最高的时间、组织等。应用最低代次的基础种子试验。应根据菌（毒）的特点制定试验方案，包括试验动物的品种、日龄、数量、级别，接种时间、途径和接种量（一般为使用剂量的100倍），传代方法，观察内容和时间，微生物分离鉴定方法，以及传代后毒力返强程度的评价标准。在传代过程中，应根据菌（毒）种在靶动物体内的增殖特点，在适宜时间采集含菌（毒）量最高的组织、血清（如：PRRSV接种后第5天病毒载量最高采血清）、分泌物或排泄物，经适当处理作为继代接种物，以确保微生物的重分离率和传代成功率。禁止将重分离的微生物在体外增殖后再进行传代。应使用基础种子的最低代次对第一组试验动物进行接种。应采用适当的检测方法，鉴定分离物中是否存在被检微生物，并测定其含量。继代：由前次接种动物分离到的材料，按照与第一次传代相同的途径接种继代动物。每一次继代后的病原应进行重新分离与鉴定。传代次数：在靶动物体内连续传代次数一般不少于5代（即首次接种后要进行4次继代）。观察：每一次继代后应在适当的时间内观察接种动物是否出现由于疫苗株毒力返强所导致的临床症状指标和病理变化。最后一次传代观察时间应在接种后至少观察21天。比较不同代次接种动物的临床变化及病理变化，特别应对最后一代传代动物与第一代传代动物的临床症状和病理变化进行对比。如：PRRSV应观察第一代与最后一代动物的肺、实质器官（心、肝、脾、胃、肾）、淋巴结等组织的组织病理变化（要做切片对比）。病原学鉴定：必要时，应对最后一次传代的分离物进行表型和基因型鉴定，并与基础种子进行比较，以评估其遗传稳定性和毒力返强的可能性。（7）鉴别检验或特异性鉴定应采用适宜方法鉴别疫苗株，并尽可能与相关毒株相区别。如荧光抗体试验、毒种的血清中和试验、菌种的试管凝集试验、菌种的玻片凝集试验或菌种的生长特性检验。血清中和试验应采用标准血清中和，不能用自分离的血清。（8）纯粹性（纯净性）检验按照药典进行。（猪外源病毒增加PCV2）（9）保存期试验稳定性试验：确定基础种子在特定保存条件下的保存期。基础种子保存期试验如何做？做多少项目？国内外没有一个统一的标准。最高标准按毒种标准，每一项都要做；最低标准仅做含量测定。专家个人观点，除做含量测定外，灭活疫苗应增加毒力测定项，活疫苗应增加免疫原性测定项。5种子批管理原则一般不能用基础毒种传代5代以上或基础菌种传代10代以上制备疫苗。如果将这种代次范围之外的基础种子用于生产，应通过进一步的试验加以证明。从生产种子批中取出的种子，增殖一次后获得的菌（毒）培养物，即应用于制备疫苗，不得再回冻保存和再次用于生产。应阐述基础种子和生产种子的保存与使用方法，包括在生产工程中如何确保所用种子不超过批准的最高代次等详细情况。应保存有足够量的基础种子，供有关部门进行检验用。二、实验室安全试验预防、治疗用兽用生物制品，其质量考察有3个重要指标。即：安全性、有效性和质量可控性。诊断制品3个重要指标是敏感性、特异性和质量可控性。可见预防、治疗用兽用生物制品的安全性是第一位的。实验室的基本要求是符合国家规定的生物安全标准。1实验动物基本要求实验动物应符合兽药典中生产、检验动物标准。实验猪筛选一般应检测CSFV、PRRSV、PRV、PPV、PCV2以及疫苗对应抗原抗体。安全试验多使用靶动物进行。有的制品还须用敏感的小型实验动物（如啮齿类）进行试验。检验细胞培养代谢产物的安全性。应使用敏感性最高的品系动物进行安全试验。应使用最小日龄的动物进行安全试验。与繁育有关的制品，应使用怀孕动物进行安全试验。每批制品的实验室安全试验中所用的动物数量应不少于10只（头），来源困难或经济价值高的不少于5只（头）。分组应随机。每只动物均应编号。2实验室制品基本要求实验室安全试验中所用实验室制品的生产用菌（毒）种、制品组成和配方等，应与规模化生产的产品相同。实验室制品应编制批号，并经过必要的检验，且结果符合要求。实验室制品中主要成分的含量应不低于规模化生产时的出产标准。3制定安全试验设计方案内容包括受试制品的批号，剂量，试验开始和结束日期，试验动物的年龄、品种、性别等特征，对照组的设置，每组动物的数量，实验动物来源、圈舍、试验管理和观察方式，结果的判定方法及标准等。还应根据制品的特点增加安全试验。安全试验要求的实验室基本条件、实验动物基本要求、实验室制品基本要求和试验方案等适用于效力试验等其他试验。4一次单剂量接种安全试验按照推荐的接种途径，用适宜日龄的靶动物，接种1个使用剂量，至少观察2周。评估指标包括临床症状、体温、局部炎症、组织病变等。对于可用于多种动物的生物制品，应该用各种靶动物进行一次单剂量接种安全试验。对于多种接种途径，应进行多种接种途径的一次单剂量接种安全试验。所有的安全试验研究者均应签名。5单剂量重复接种安全试验（可能不适用）对可能进行多次接种的生物制品，均须进行该试验。按照推荐的接种途径，用适宜日龄的靶动物，接种1个使用剂量后2周，以相同方法再接种一次，再次接种后应继续观察至少2周。评估指标包括临床症状、体温、局部炎症、组织病变等。对于可用于多种靶动物和多种接种途径的生物制品，应进行多种靶动物和多种接种途径的单剂量重复接种的安全试验。6超剂量接种安全试验用至少3批实验室制品对靶动物进行一次超剂量接种的安全试验。用适宜日龄的靶动物，接种剂量为免疫剂量的数倍至一百倍不等。通常情况下，灭活疫苗为2倍，活疫苗为10~100倍，至少观察2周。评估指标包括临床症状、体温、局部炎症、组织病变等。对于可用于多种靶动物和多种接种途径的生物制品，应进行多种靶动物和多种接种途径的超剂量接种的安全试验。7对怀孕动物的安全试验（可能不适用）对用于妊娠动物的制品，应使用妊娠期动物进行安全试验，考察制品对妊娠、胎儿健康的影响。另外，有些病原可能导致生殖系统的不可逆损伤，这类制品的安全试验中，应对幼龄动物接种后，一直观察到产仔，以考察其对生殖功能的影响。8对靶动物生产性能的影响试验对用于肉用商品代经济动物及产蛋鸡的生物制品应进行本试验；使用这类制品后，应观察记录动物的生长发育、增重、饲料报酬、出栏率、产蛋鸡的产蛋率等，评估生物制品对动物生产性能的影响。9对非靶动物、非使用日龄动物的安全试验有些病原可感染多种动物或多个日龄段的动物，这类制品的安全试验中，还应对非使用对象动物和非使用日龄动物进行实验室安全试验，以考察对靶动物群使用