生物制品-第三章生物制品课件

第三章灭活剂、保护剂、与免疫增强剂第一节灭活剂一、灭活与灭活剂（一）灭活：杀死病原微生物，但不影响免疫原性；其次是破坏血清的补体，以免干扰血清学反应结果。灭活剂：灭活微生物的化学试剂。灭活方法：物理灭活：加热、超声波及射线灭活微生物，此方法免疫原性易破坏，现很少使用（血清56°C半小时灭活补体用此方法）。化学灭活：用化学试剂将病原微生物杀死，此方法经常使用。二、常用的灭活剂种类和原理（一）甲醛：是最古老常用的灭活剂，现在我国用的26种灭活疫苗，均以甲醛为灭活剂。性质：甲醛为刺鼻的气体，水溶液叫福尔马林，浓度为36%-40%。10°C以下易聚合成三聚甲醛或多聚甲醛，为白色沉淀。原理：甲醛的醛基起灭活作用，可使蛋白质的氨基→羟甲基胺羧基→亚甲基二醇单酯羟基→羟甲基酚巯基→硫代亚甲基二醇浓度：需氧菌甲醛浓度到0、1%--0、2%.厌氧菌0、4%--0、8%.病毒0、05%--0、4%.原则是浓度低，时间短，温度低可以灭活细菌，尽量减少破坏抗原（通常加入量，以甲醛含量量计算，折合福尔马林浓度）。（二）烷化剂：将烷基引入，形成烷基取代物，使微生物变性死亡。原理：主要破坏病毒的核酸，作用于A：G碱基，引起DNA单链断裂或双链铰连。此类常用于病毒灭活，种类有AEI—N-乙酰乙烯亚胺，加入浓度到0、05%。BEI—二乙烯亚胺，浓度0、02%；EEI—2—乙基乙烯亚胺，GDA—缩水甘油醛。灭活后加硫代硫酸钠可终止灭活，防止抗原损失。保存：AEI，0--4°C一年，--20°C二年；BEI0--4°C保存一个月。（三）苯酚（石碳酸）人类用的第一个消毒药，具有特殊气味的无色结晶，易潮解成水溶液，与光、氧后颜色变紫色。原理：蛋白质变性以及抑制氧化脱氢酶，芽孢和病毒对它抵抗力强。灭活浓度：抑菌作用是0、2—0、5%（血清防腐），杀菌是1%，杀葡萄球菌是3%。消毒常用它的衍生物，来苏儿（甲酚皂）3—5%浓度，特殊气味，覆盖其他气味，也是医院常用的。(JosephLister,1827~1912)首创用石炭酸喷洒手术室和煮沸手术用具以防术后感染，为防腐、消毒，以及无菌操作奠定了基础。（四）结晶紫（龙胆紫），也叫紫药水，碱性染料，也叫甲紫或甲基青莲，化学名，六甲基副玫瑰苯胺。原理：碱性阳离子可结合细菌阴离子羧基；干扰细胞壁粘肽合成；常作用于革兰氏阳性菌。生物制品的应用有猪瘟结晶紫疫苗，鸡白痢染色抗原。（五）β—丙酰内酯良好病毒灭活剂，性状是无色有气味液体，易潮解和高温失效，5°C密封保存好，现主要用于狂犬灭活苗。另还有防治细菌霉菌生长的防腐剂：硫柳汞（乙基汞硫代水杨酸钠），叠氮钠（NaN3）它们使用浓度0、01-0、02%。可防止血清腐败。三、影响灭活作用的因素（一）药物的特异性：酚类不能杀灭真菌和病毒，阳离子的结晶紫，主要作用于G+菌。（二）微生物的种类和特异性：G+菌和G-菌对药物敏感不一样，繁殖体和芽孢对药物敏感也不一样。（三）药物浓度：浓度愈大，灭活越快，抗原也损失大；但是，95%酒精没75%酒精杀灭细菌好。（四）温度：温度与灭活成正比，每升高10度，金属类杀菌作用增加2—5倍。但高温超过40°C，抗原也损失大。（五）时间：灭活时间与温度和浓度成反比，即灭活杀菌长，温度旧低，浓度也低，就可以杀灭细菌。（六）pH：碱性快，酸性慢，酸性环境对抗原保护好。（七）有机物存在：环境的有机物减低灭活的效果，微生物也是有机物。四、灭活疫苗时的注意事项1.2人参加灭活，注意药品名和量，灭活后标记。2.37°C灭活一天后，接种适宜培养基—无菌检查。3.动物试验，灭活苗制成后，注射小白鼠0、2ml，两只，观察3天。4.使用试验：用户可先注射1-2头，观察1—2天，看有无过敏，应激等反应，证明安全，才全群使用。思考题：1.什么叫灭活和灭火剂？2.灭活剂的种类有哪些？3.影响灭活的因素是什么？4.灭活的注意事项有哪些？第二节保护剂保护剂也叫稳定剂，是防止微生物在冻干过程中受到破坏。按作用原理分两类：渗透剂：能渗入细胞，使胞内外渗透压平衡，防止慢冻时损伤细胞。有甘油，蔗糖，二甲基亚砜。非渗透剂：防止细胞内外物质交换在速冻时保护细胞。有蛋白质，聚乙烯吡咯酮。按保护剂分子量分类：低分子量保护剂：糖、氨基酸类。高分子量保护剂：脱脂牛奶、明胶。按化学性质分类：复合物：脱脂牛奶，血清。糖类：蔗糖、乳糖。盐类：乳酸钙、谷氨酸钠。醇类：甘油，山梨醇，甘露醇。酸类：柠檬酸，氨基酸。聚合物：葡聚糖，聚乙烯吡咯酮。一、冻干保护剂的组成和作用按组成将保护剂分为营养液，赋形剂，抗氧化剂。营养液：使受损细胞修复：脱脂牛奶，蛋白质，氨基酸，糖类。赋形剂：骨架作用，制品形成网孔结构，易溶解----蔗糖，乳糖。抗氧化剂：保护酶类，防止氧化—VC，VE，硫代硫酸钠。保护剂的作用：1.防止细胞内水结晶和细胞失去水分。2.平衡细胞内外渗透压，防止细胞破裂。3.助于细胞修复以及冻干后复苏。二、影响保护剂效果的因素判断保护剂的好坏，从冻干后的存活率，以及生物制品的保质期研究。然后对不同物质筛选不同配方，选出好的保护剂。1、保护剂的种类：不同微生物用不同的保护剂。2、保护剂的浓度：5—10%的葡萄糖保存大肠杆菌存活率高。3、保护剂配制方法：糖、血清、维生素不能高温灭菌，糖可以114°C30分钟灭菌，其他可以过滤除菌。4、保护剂的pH：一般为6-8。三、常用的保护剂生物制品保护剂很多，各国家不同，如鸡新城疫苗（ND），我国是5%蔗糖脱脂牛奶；日本是5%乳糖、0、15%聚乙烯吡咯酮、1%马血清。(一)不同微生物用不同保护剂1.细菌疫苗：10%蔗糖；5%蔗糖脱脂牛奶；5%蔗糖、1、5%明胶；10-20%脱脂牛奶。2.厌氧菌苗：0、1%谷氨酸钠、10%乳糖；10%脱脂牛奶；7、5%葡萄糖血清。3.病毒疫苗：多用混合保护剂，如5%蔗糖脱脂牛奶。(二)几种常用的保护剂1.5%蔗糖脱脂牛奶—新城疫疫苗2.明胶蔗糖保护剂---禽霍乱疫苗3.聚乙烯吡咯酮乳糖—厌氧菌4.SPGA（蔗糖76、62g，磷酸二氢钾0、52g，磷酸氢二钾1、62g，谷氨酸钠0、83g，牛血清蛋白10g，去离子水1000ml）鸡马立克氏疫苗。(三)保护剂的添加：一般是疫苗和保护剂1：1加入（5%蔗糖脱脂牛奶—新城疫疫苗），还有是按疫苗量加入保护剂到规定浓度（如5%蔗糖明胶保护剂，加疫苗是先配浓度高的40%的蔗糖、12%明胶，然后按疫苗7份，保护剂1份混合。）。弱毒疫苗饮水：加0、2%奶粉，以中和水中的有害离子和毒性物质。思考题：什么叫保护剂？组成和作用是什么？影响保护剂效果的因素有哪些？常用保护剂有哪些？第三节免疫佐剂一、佐剂的概念和原理：（一）概念：adjuvant一词来源于拉丁语，即辅佐之意。免疫佐剂是一种非特异免疫增强剂，先注射或和抗原同时注射，能明显增强免疫反应。最新概念：凡是增强抗原特异性免疫反应的物质，均叫佐剂。（二）佐剂具备的条件1、安全无毒副作用。2、无致癌性。3、纯度高，吸附力强，易吸收。4、不含与动物交叉免疫的抗原物质。5、不引起机体对自身超敏性。6、耐储存，1年以上，不变质。（三）作用机理：1.抗原递程—助于吞噬细胞的吞噬和抗原传递。引起细胞浸润。2.抗原寻找—增加抗原目标，改变抗原构型，吸引吞噬细胞；延长体内储存。3.免疫调节—增强免疫应答，包括细胞免疫和体液免疫。佐剂的分类：1.按物理性质：颗粒型佐剂，非颗粒佐剂。2.按生物学性质：微生物和非微生物佐剂。3.按存储时间：储存型和非存储型。（一）颗粒型佐剂—将抗原包括成颗粒状。1、盐类佐剂—氢氧化铝胶，明矾，磷酸三钙等。2、油类佐剂A、弗氏佐剂：1935年，美籍匈牙利学者Freund发明，分弗氏不完全佐剂：矿物油75-85%+加羊毛脂（乳化剂）15—25%，充分乳化即成，简写FIA,Freundsincompleteadvuant；弗氏完全佐剂：是在FIA中加入死结核杆菌或卡介苗即成，缩写FCA.。B、矿物油司本佐剂（现在经常用的，以后专讲）3、免疫刺激复合物佐剂—简写ISCOM佐剂（皂苷类）。4、蜂胶佐剂5、脂质体佐剂其它佐剂—MF59，微胶囊佐剂。（二）非颗粒佐剂1.肽类佐剂：胞壁酰二肽（结核杆菌细胞壁），脂肽及免疫调节多肽。2.表面活性剂：海藻糖合成的衍生物。3.核酸类：合成核苷酸聚合体，次黄嘌呤衍生物，免疫刺激序列DNA。4.含硫复合物：左旋咪唑（既可驱虫，又可免疫增强）。5.高分子碳水化合物，香菇多糖。6.细胞因子：IL—1、2、4；干扰素，转移因子等。7.其它，霍乱毒素，类毒素。三、常规免疫佐剂（一）盐类佐剂1926年Gleny使用铝胶佐剂，几十年来，人畜疫苗已经广泛使用该佐剂。作用机理：a，储存和延缓吸收；b、增加抗原表面积；c、形成巨噬细胞肉芽肿（增强体液和细胞免疫）。1、氢氧化铝胶合成方法：有三种，铝粉加烧碱；明矾加碳酸钠以及明矾加氨水等。明矾加氨水方法：20%澄清的明矾水，温度60度，边搅边加氨水，到pH8时停止，然后打磨均匀，清水漂洗多次硫酸根离子，到pH7时既可，装瓶高压灭菌，用时20%加入疫苗。2、明矾：有钾明矾和胺明矾，主要是吸附、沉淀、浓缩作用；精致10%明矾水，灭菌，25度保存，按疫苗量1—2%加入，摇匀即可，有沉淀作用。主要用于破伤风类毒素的沉淀和气肿疽灭活疫苗的使用。3、磷酸三钙佐剂，与铝胶同样作用，制作简便。将灭菌的20%氯化钙2、5ml加入100ml疫苗中摇匀，再加入20%磷酸氢二钠7、5ml，摇匀即成白色絮状沉淀。加的次序不能错，该佐剂沉淀作用比铝胶强。（二）油类佐剂（矿物油司本佐剂）乳化剂是一种降低其它溶液表面张力作用的物质，可使一种物质分散混合于另一不相容的液体中。司本80或吐温80既是乳化剂。他们可使油类和水剂疫苗乳化均匀。疫苗水剂是分散相（内相）,油类为连续相（外相），两者中间是乳化剂，可以做成油包水，W/O；也可以做成水包油，O/W;前者不易吸收，储存时间长。后者容易吸收和释放。最常用是白油司本佐剂方法：制备油相：94%杭州10号白油，加6%司本80（HLB，亲水亲油值，值高亲水强，值低亲油强），HLB是4、2，混合后加2%硬质酸铝，熬化溶解，高压灭菌备用。水相：疫苗加4%吐温80（HLB15）搅拌均匀即成。按油：水，3—1：1进行高速搅拌或胶体磨磨3遍就成。如果搅拌油中慢慢加入水相，制成是油包水，W/O，反之是水包油，O/W。油乳疫苗检验：1、粘度检测：口径Ф1、2mm吸管，吸1ml乳剂，放出0、4ml的时间在2—6秒为宜，不可多于10—15秒，注射困难。2、稳定性检查：①加速老化试验，37度，10—30天，不破乳；②离心3000转/分钟，15分钟不分层，可以保存一年。（三）蜂胶佐剂1、蜂胶的理化特性：蜂胶含树脂、蜂分泌物，蜂蜡、花粉及其它多种物质，为固体粘稠状，冷硬热软，灰褐色，20-40度发粘，15度下变硬脆，60-70度液化。等级：乙醇溶解后测含量，含66-70%为一级；61-65%为二级；56-60%三级；50-55%是四级。方法：2、5克蜂胶，加乙醇25ml冷浸24h，滤纸过滤，45度干燥，计算浸出物的含量。2、作用：抗菌抗病毒、抗肿瘤、消炎和免疫增强作用。3、蜂胶的使用①蜂胶处理：温度4-8度粉碎，过筛，1：4加入乙醇浸泡24-48h，滤纸过滤去渣，算出含量，4度保存。②蜂胶的加入：一般按疫苗量的到10mg/ml，摇匀成乳浊状。山东滨州兽医研究所生产蜂胶系列疫苗。第四节新型免疫佐剂一、细胞因子佐剂（一）细胞因子的概念和分类概念：是细胞释放出类似激素作用的生物效应物质，在免疫应答中起重要作用。分类：经典细胞因子：淋巴毒素，肿瘤坏死因子，干扰素。免疫调节因子：白细胞介素，集落刺激因子。（二）作用特点：三多一高一快。多效性—非特异免疫调节多源性—多种细胞可以产生一种因子