第四章-核酸ppt

核酸化学研究史：1869年Miescher,研究细胞核化学成分时发现的这种含磷很丰富的酸性物质。故命名“核质(Nuclein)”第四章核酸1879年Kossel经过10年的努力,搞清楚核质中有四种不同的组成部分:A,T,C和G；1889年Altman建议将“核质”改名为“核酸”,因为已经认识到“核质”乃“核酸”与蛋白质的复合体。一、概念核酸(nucleicacid)是由碱基（嘌呤和嘧啶）、戊糖和磷酸组成的高分子物质，是生物体的基本组成，其结构单元分子为核苷酸。第一节核酸的分类与组成二、种类及分布1、种类脱氧核糖核酸（DNA）核糖体RNA(rRNA)核糖核酸（RNA）转运RNA(tRNA)信使RNA(mRNA)2、分布DNA：主要在细胞核中，是染色体的主要成分。此外在线粒体、叶绿体、质粒上。RNA：细胞核——核仁；细胞质——核糖体及上清液中。三、核酸的组成核酸是一种线形多聚核苷酸(polynucleotide),其基本结构单位是核苷酸(nucleotide)。戊糖碱基磷酸核苷核苷酸核酸核苷酸的基本结构（一）核酸中的戊糖D-核糖（D-ribose）D-脱氧核糖（D-deoxyribose）核酸据此分类：脱氧核糖——DNA；核糖——RNA；核酸中的戊糖均为β-D-型（二）碱基尿嘧啶胸腺嘧啶胞嘧啶核酸中的碱基分两类：1、嘧啶碱基(pyrimidine)：是嘧啶的衍生物。NN1234562、嘌呤碱(purine)：由嘌呤衍生而来。腺嘌呤鸟嘌呤尿嘧啶胞嘧啶胸腺嘧啶3、稀有碱基一些修饰碱基，因含量甚少而称之。大多为甲基化碱基，多在tRNA中。（三）核苷(nucleoside)1、连接方式核苷：戊糖与碱基缩合而成，并以糖苷键相连接。糖苷键：二者的连接是C-N键，称C-N糖苷键。1’2’3’4’5’(OH)2、核苷的命名、符号核苷名称由相应的碱基名和戊糖名加苷而产生全名为“某碱基核糖核苷”或“某碱基脱氧核糖核苷”简化为“某苷”或“脱氧某苷”。如腺苷、脱氧腺苷。核苷符号依据相应碱基而来，对于脱氧核苷则在碱基代号前加“d”。AGCUdAdGdCdTDNA、RNA分别有四种核苷（四）核苷酸(nucleotide，nt)1、种类：1）按酯化位点：可在核糖的2’-,3’-,5’-；2）按核糖类型：核苷酸、脱氧核苷酸1、概念核苷中戊糖的羟基被磷酸酯化，即为核苷酸。2’，3’，5’一核糖核苷酸(2´-AMP)(3´-AMP)(5´-AMP)Deoxyadenosine3’-monphosphate(3’-dAMP)Deoxyadenosine5’-monphosphate(5’-dAMP)3’，5’-脱氧核苷酸（deoxyribonucleotide）2、结构3、表示与一个磷酸结合——MP：(d)AMP、(d)GMP、(d)CMP、(d)TMP、UMP与二个磷酸结合——DP：如：ADP与三个磷酸结合——TP：如：4、特殊核苷酸1）环核苷酸：核糖3’-,5’-成环。cAMP、cGMP功能：第二信使，激素、一些药物、神经递质通过其发挥生理作用。2）其他核苷酸主要起调节作用，如：ppGpp：鸟苷—5′—二磷酸—3′—二磷酸（五）多聚核苷酸（核酸）多聚核苷酸是通过一个核苷酸的C3′-OH与另一分子核苷酸的5′-磷酸基形成3′,5′-磷酸二酯键相连而成的链状聚合物。5’5’3’3’5′-磷酸端（常用5’-P表示）；3′-羟基端（常用3’-OH表示）多聚核苷酸链具有方向性，当表示一个多聚核苷酸链时，必须注明它的方向是5′→3′或是3′→5′。多聚核苷酸的表示方式DNARNA5′PdAPdCPdGPdTOH3′5′PAPCPGPUOH′或5′ACGTGCGT3′5′ACGUAUGU3′ACGTGCGTACGUAUGUT5’3’OHU5’3’OHOHOHOHOH（六）RNA和DNA组成AGCUAGCTD-核糖D-2-脱氧核糖磷酸磷酸胞质胞核主要碱基戊糖磷酸部位RNADNA第二节核酸的性质一、一般理化性质（一）两性电解质：由于核酸、核苷酸中含有碱基和磷酸基，而呈两性电离，是两性电解质。磷酸基比碱基更易解离，故核酸表现为酸性。（二）核酸的水解1、碱水解：室温，稀碱下，RNA可水解为核苷酸；DNA不能水解。2、酸水解：稀酸长时间或高温或强酸处理核酸，可促使核酸发生糖苷键、二酯键水解。3、酶水解：核酸酶、核苷酸酶等，详细见“核酸代谢”。（三）沉降特性由于溶液中的核酸在离心场中可下沉，因而可用超离心法纯化核酸，沉降速度有差异：RNA环形DNA线形DANPRO或将不同构象的核酸分离，也可测沉降系数和分子量。RNA：蔗糖梯度超离心DNA：氯化铯梯度超离心（四）粘度DNA粘度比RNA大。当受热或其他因素，由螺旋变为无规则时，粘度下降，可作变性指标。（五）颜色反应：1）核糖与浓盐酸和苔酚蓝共热呈绿色，在670nm处可测RNA；2）2-脱氧核糖与酸和二苯胺共热呈蓝紫色，在595nm处可测DNA。二种反应可作定性试验，定量试验灵敏度低、准确性差，但快、简便。二、紫外吸收性质碱基具共轭双键强烈吸收260-290nm波段紫外光，最大吸收峰在260nm附近。应用：1、不同核苷酸有不同吸收特性，可用紫外分光光度计进行定性、定量测定。1OD相当于：50μg/mlDNA40μg/mlRNA20μg/mlNt(核苷酸）2、确定所提取的核酸是否纯品。1）DNA：≈1.8纯品OD260/OD290＞1.8RNA污染＜1.8pro污染2）RNA：OD260/OD290≈2.0纯品3、紫外可使相邻TT间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体，引起基因突变。A=TC=GT=AT=A紫外A=TC=GTATA三、核酸结构的稳定性1、碱基堆积力：双螺旋内部碱基形成的疏水区；2、碱基间的氢键：3、磷酸基与介质中阳离子形成的离子键4、范德华力。四、核酸的变性1、变性的概念在某些理化因素作用下（温度、酸碱、有机溶剂、尿素等），核酸分子互补双链之间氢键断裂，使双螺旋结构松散变成单链的过程。1）结果：A、增色效应：260nm紫外吸收增加；B、粘度下降、浮力密度上升；C、生物学性能部分或全部丧失。2）引起变性的因素：温度、pH、尿素、甲醛等。2、热变性与TmTm：在热变性中，紫外吸收增加的中点值所对应的温度，称该DNA的熔解温度（meltingtemperature,Tm);又称热解链温度。3、影响Tm的因素1）DNA的均一性；2）G-C含量：Tm与G-C含量成正比。3）介质中的离子强度：离子强度低，Tm低，熔解温度范围窄。DNA分子的Tm与GC含量的关系盐浓度对DNA变性的影响五、核酸的复性概念：变性DNA在适当条件下（缓慢降温），可使两条彼此分开的链重新缔合成双螺旋结构的过程。复性后，许多物化性质可得到恢复，生物学活性部分恢复。影响因素：温度、DNA片段大小、DNA浓度、碱基重复序列多少、离子浓度。DNA变性与复性六、分子杂交不同来源的核酸经变性和复性的过程，其中一些不同的核苷酸单链由于存在局部碱基互补片段，而在复性时形成杂化双链，此过程称分子杂交。加热退火七、核酸序列测定原理：碱基配对；聚合酶可催化在试管内合成与模板互补的DNA新链；双脱氧核苷酸无3’-OH，合成到此终止；可电泳分离随机得到的大小不等的片段。DNA序列测定末端终止法：待测单链DNA模板引物四种dNTP(其中一种用32P/35S标记)终止剂(ddNTP)DNA聚合酶Sanger发明：两次获得诺贝尔奖分别得到ddAddTddGddC结尾的片段测序过程:1.模板与引物杂交2.引物的延长和合成阻断四个试管分别加入DNA聚合酶dNTP标记底物终止剂不同ddAddGddCddT四个试管中所有产物是一系列长度只差一个核苷酸的聚合链3.电泳ACGT次序高压电泳4.放射自显影得到直读图象核酸序列测定2006-9第五章核酸化学49核酸的连接方式5磷酸基末端3羟基末端3,5-磷酸二酯键第三节核酸的结构与生物功能一、核酸的一级结构多核苷酸链中各核苷酸残基的排列顺序称~。1）一级结构表示方法如下：A、磷酸（P）的位置在左：表示与5′-OH结合；在右：与3′-OH结合如：pApCpTpGB、箭头表示核酸酶的水解部位：pApCpTpG，即C的3′-OH游离。C、一般将碱基缩写用连字符连起表示，如：A-C-G-U2）读向：碱基序列从左到右表示5′——3′，由3′-,5′磷酸二酯键连接。若两链反向平行，则需注明每条链的走向。如：5′A-T-G-C-C-T-G-A3′3′T-A-C-G-G-A-C-T5′1、ＤＮＡ分子碱基组成特征（１）嘌呤碱基等于嘧啶碱基，即Ａ＋Ｇ＝Ｔ＋Ｃ（２）腺嘌呤与胸腺嘧啶等量存在，鸟嘌呤与胞嘧啶等量存在，即Ａ／Ｔ＝Ｇ／Ｃ＝１这一特点对于ＤＮＡ双螺旋结构模型的提出具有重要意义。二、DNA的双螺旋二级结构双螺旋结构模型建立的依据：1）根据DNA碱基组成的定量分析提出chargaff碱基配对原则：A=T，G=C2）根据对DNA纤维和晶体的x-衍射分析。Watson-Crick的DNA双螺旋2.0nm结构特征2、双螺旋结构的特点:(Watson-Crick模型）1）形成两条链反向平行；以相同的旋转绕同一个公共轴形成右手螺旋。2.0nm小沟大沟碱基按互补配对原则进行配对，A与T配对，之间形成两个氢键，C与G配对，之间形成三个氢键。DNA中的四种碱基及它们间的氢键胞嘧啶胸腺嘧啶鸟嘌啉腺嘌啉TCAG2）结构A、核糖-磷酸以3′-,5′磷酸二酯键连接成骨架位于双螺旋的外侧；碱基位于链的内部；B、大沟、小沟。大沟小沟3）尺寸A、螺旋直径：2nm；B、碱基距离：0.34nm；C、螺距：3.６nm；D、一周10.５个核苷酸。4）双螺旋的稳定性A、氢键（横向）B、碱基对疏水的芳香环堆积所产生的疏水中作用力（纵向）C、离子键DNA右双螺旋结构模型要点总结（Watson,Crick,1953）1、右双螺旋，反向平行2、碱基在内，主链在外3、碱基互补，A＝T，G≡C4、螺旋一圈，十对碱基5、结构稳定，副键维系6、大沟小沟，调节关键A-DNAisfavoredwhenDNAisdehydrated.Majorandminorgroovesaresimilarinwidth.B-DNAistheconformationnormallyfoundinsidecells.Z-DNAisfavoredincertainG/C-richsequences.Nogrooveslefthandedhelix染色体在真核细胞染色质中，DNA双螺旋分子盘绕在组蛋白上形成核小体。许多核小体由DNA连成念珠状结构，再盘绕压缩成高层次的结构———染色体。DNA是遗传信息的载体半保留复制保证了亲代性状传到子代，保证了亲代与子代的相似性。三、RNA（一）RNA的结构组成：4种核苷酸，有稀有碱基；连接：同DNA形成：一般以DNA为模板合成，有例外（病毒ＲＮＡ）。结构：单链线形分子，局部区域有双螺旋。（二）RNA的类型三种：信使RNA（messengerRNA,mRNA)核糖体RNA(ribosomelRNA,rRNA)转运RNA(transferRNA,tRNA)此外，在真核细胞中还有少量：核内小RNA（snRNA）:参与核糖体的组成。不均一RNA（hnRNA）：mRNA的前体。反义RNA（asRNA）：可与mRNA部分或全部序列互补；抑制DNA复制、转录；抑制mRNA翻译。m7GpppAUGGUG………………UAAAAA……An5´3´5´帽子结构密码子3´多聚A尾真核细胞mRNA的3′-末端有一段长达200个核苷酸左右的聚腺苷酸(polyA)，称为“尾结构”，5′有一个甲基化的鸟苷酸，称为”帽结构“。１、mRNAmRNA一般呈单链，分子大小不一。可以自身回折成一般RNA的二级结构，如发夹式。“帽子结构”的作用：–防止mRNA被降解–蛋白质生物合成时被起始因子识别的标志“PolyA的作用”：引导mRNA由胞核转移到胞质功能：蛋白质生物合成的膜板，mRNA分子中每三个相邻