TAKARA荧光定量说明书(中文)

TaKaRaCode：DRR820ASYBR®PremixExTaqTMII(TliRNaseHPlus)（200次量）说明书宝生物工程(大连)有限公司目录内容页码●制品说明1●制品内容1●适用的RealTimePCR扩增仪1●保存1●试剂盒原理1●试剂盒特长2●操作注意2●操作方法2◆应用ThermalCyclerDice®RealTimeSystem扩增仪的操作方法2◆应用ABIPRISM®7300/7500/7500FastReal-TimePCRSystem和StepOnePlusTMReal-TimePCRSystem的操作方法4◆应用LightCycler®RealTimePCR扩增仪的操作方法6●实验条件的选择7●进行RT-PCR反应时的实验方法8●反应例8●引物设计说明9●引物设计服务说明：本公司提供用于基因表达定量分析的引物设计及合成服务9本制品请于4℃避光保存，避免-20℃保存制品！◆特别提示：●制品说明本制品是采用SYBR®GreenI嵌合荧光法进行RealTimePCR的专用试剂。制品中含有RealTimePCR反应的最适浓度SYBR®GreenI，是一种2×浓度的PremixType试剂，进行实验时，PCR反应液的配制十分方便简单。本制品中还添加了TliRNaseH(耐热性RNaseH)，以cDNA作为模板进行PCR反应时，可以最大限度抑制由于cDNA中残存mRNA对PCR反应造成的阻害作用。本制品Buffer经过改良，使反应特异性比SYBR®PremixExTaqTM(TliRNaseHPlus)（TaKaRaCode：DRR420）更高。能抑制非特异性反应，可以在宽广的范围内进行更加准确的定量。本Buffer和改良后的HotStart法用DNA聚合酶TaKaRaExTaq®HS组合使用，可以进行再现性好、可信度高的RealTimePCR解析。●制品内容（50μl反应×200次）SYBR®PremixExTaqTMII（TliRNaseHPlus）（2×Conc.）*11.0ml×5支ROXReferenceDye（50×Conc.）*2200μl×1支ROXReferenceDyeII（50×Conc.）*2200μl×1支*1内含TaKaRaExTaq®HS，dNTPMixture，Mg2+，TliRNaseH，SYBR®GreenI等。*2只使用在ABI、Stratagene等公司的RealTimePCR扩增仪上，用以校正孔与孔之间产生的荧光信号误差。ABIPRISM7300Real-TimePCRSystem和StepOnePlus使用ROXReferenceDye，7500Real-TimePCRSystem和7500FastReal-TimePCRSystem使用ROXReferenceDyeII。ThermalCyclerDiceRealTimeSystem、LightCycler等RealTimePCR扩增仪不必使用。●适用的RealTimePCR扩增仪ThermalCyclerDice®RealTimeSystem（TaKaRaCode:TP800）AppliedBiosystems7300/7500/7500FastReal-TimePCRSystem、StepOnePlus™Real-TimePCRSystem（AppliedBiosystems）LightCycler®（RocheDiagnostics）其他各种RealTimePCR扩增仪注：SmartCycler®System/SmartCycler®IISystem（Cepheid）建议使用SYBR®PremixExTaqTM(TliRNaseHPlus)（TaKaRaCode：DRR420）。●保存：4℃避光保存，避免冻结制品。-20℃反复冻融制品性能可能下降，请避免-20℃保存制品。●试剂盒原理本制品使用了改良后的TaKaRaExTaqHS进行PCR扩增，通过检测反应液中SYBRGreenI的荧光强度，达到监控PCR产物扩增量的目的。1．PCRPCR法是以微量DNA进行目的片段扩增的方法。通过DNA链的热变性、引物退火、DNA聚合酶作用下引物的延伸三个步骤循环往复，可在短时间内扩增DNA达100万倍以上。本制品中的DNA聚合酶由于使用了改良后的TaKaRaExTaqHS，从而抑制在调制反应液等低温条件下由引物产生的非特异性退火或引物二聚体引起的非特异性扩增，大大提高PCR扩增灵敏度。2．嵌合荧光检测法。SYBR®GreenI与双链DNA结合后发出荧光，所以可以通过检测反应体系中的SYBR®GreenI荧光强度，达到检测PCR产物扩增量的目的。具体原理见下图。通过PCR反应生成双链DNA，SYBR®GreenI与双链DNA结合发出荧光，通过检测PCR反应液中的荧光信号强度，可以对目的基因进行准确定量，同时还可以测定扩增的目的DNA片段的融解温度。-1-Primer荧光物质2．引物退火Polymerase3．延伸反应1．热变性●试剂盒特长1．适用于RealTimePCR反应，可以快速、准确地对目的基因进行检测、定量。2．在2×浓度的Premix中，预先混有SYBR®GreenI，PCR反应液配制时，只需加入模板、引物、灭菌蒸馏水便可进行RealTimePCR反应，操作简单方便。3．DNA聚合酶使用了改良后的TaKaRaExTaqHS，可以进行HotStart法PCR反应，再与TaKaRa公司独自开发的Buffer系统相结合，具有高扩增效率，高扩增灵敏度，高扩增特异性之特点。4．在2×浓度的Premix中，预先添加了耐热性RNaseH(TliRNaseH)，可以最大限度抑制以cDNA作为模板进行PCR反应时，由于cDNA中残存mRNA对PCR反应造成的阻害作用。●操作注意以下为使用本试剂盒时的注意事项，使用前一定认真阅读。1．使用时请上下颠倒轻轻均匀混合，避免起泡。（注意不要振荡混匀。）试剂要混匀后使用，避免因浓度不均而影响反应结果。2．配制PCR反应液时在冰上进行操作。3．本制品中含有荧光染料SYBR®GreenI，配制PCR反应液时应避免强光照射。4．反应液的配制、分装请一定使用新的（无污染的）枪头、Microtube等，尽量避免污染。●操作方法◆应用ThermalCyclerDice®RealTimeSystem扩增仪的操作方法请按照ThermalCyclerDice®RealTimeSystem（TaKaRaCode：TP800）的使用说明书要求进行实验操作。使用TaKaRaPerfectRealTimeSupportSystem（PRTSS）设计引物时的操作方法。①按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。试剂使用量终浓度SYBR®PremixExTaqTMII（2×）12.5μl1×PCRForwardPrimer（10μM）1μl0.4μM*1PCRReversePrimer（10μM）1μl0.4μM*1DNA模板2μl*2dH2O（灭菌蒸馏水）8.5μlTotal25μl*3*1通常引物终浓度为0.4μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.2～1.0μM范围内调整引物浓度。-2-*2DNA模板的添加量通常在100ng以下。因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的DNA模板添加量。另外，2StepRT-PCR反应的cDNA（RT反应液）作为模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。*3议反应液体积为25μl。建②进行RealTimePCR反应。建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序。由于使用Tm值较低的引物等原因，两步法PCR反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法PCR扩增反应。有关PCR的具体反应条件请参照「实验条件的选择」。两步法PCR扩增标准程序：Hold(预变性)Cycle:195℃30秒Cycle:4095℃5秒60℃30秒Dissociation◆特别提示：本制品中使用的TaKaRaExTaqHS是利用抗Taq抗体的HotStart用DNA聚合酶，与其他公司的化学修饰型HotStart用DNA聚合酶相比，不需要PCR反应前的95℃、5～15分钟的酶的活性化反应。如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其PCR的扩增效率、定量精度等都会受到影响。如果在PCR反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃、30秒。③实验结果分析。反应结束后确认RealTimePCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量时制作标准曲线等。使用PRTSS以外方法设计引物时的操作方法。①按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。试剂使用量终浓度SYBR®PremixExTaqTMII（2×）12.5μl1×PCRForwardPrimer（10μM）1μl0.4μM*1PCRReversePrimer（10μM）1μl0.4μM*1DNA模板2μl*2dH2O（灭菌蒸馏水）8.5μlTotal25μl*3*1通常引物终浓度为0.4μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.2～1.0μM范围内调整引物浓度。*2DNA模板的添加量通常在100ng以下。因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的DNA模板添加量。另外，2StepRT-PCR反应的cDNA（RT反应液）作为模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。*3建议反应液体积为25μl。-3-②进行RealTimePCR反应。建议采用下列图表显示的两步法PCR反应程序。由于使用Tm值较低的引物等原因，两步法PCR反应扩增性能较差时，可以尝试进行三步法PCR扩增反应。有关PCR的具体反应条件请参照「实验条件的选择」。两步法PCR扩增标准程序：Hold(预变性)Cycle:195℃30秒Cycle:4095℃5秒60℃30-60秒Dissociation◆特别提示：本制品中使用的TaKaRaExTaqHS是利用抗Taq抗体的HotStart用DNA聚合酶，与其他公司的化学修饰型HotStart用DNA聚合酶相比，不需要PCR反应前的95℃、5～15分钟的酶的活性化反应。如果高温处理时间过长，会使酶的活性下降，其PCR的扩增效率、定量精度等都会受到影响。如果在PCR反应前进行模板的预变性，通常设定为95℃、30秒。③实验结果分析。反应结束后确认RealTimePCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量时制作标准曲线等。◆应用ABIPRISM®7300/7500/7500FastReal-TimePCRSystem和StepOnePlusTMReal-TimePCRSystem的操作方法请按照AppliedBiosystems公司的仪器使用说明书要求进行实验操作。①按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。试剂使用量使用量终浓度SYBR®PremixExTaqTMII（2×）10.0μl25.0μl1×PCRForwardPrimer（10μM）0.8μl2.0μl0.4μM*1PCRReversePrimer（10μM）0.8μl2.0μl0.4μM*1ROXReferenceDye（50×）orROXReferenceDyeII（50×）*30.4μl1.0μl1×DNA模板2.0μ4.0μl*2dH2O（灭菌蒸馏水）6.0μl16.0μlTotal20.0μl50.0μl*4*1通常引物终浓度为0.4μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可以在0.2～1.0μM范围内调整引物浓度。*2在20μl反应体系中，DNA模板的添加量通常在100ng以下。因不同种类的DNA模板中含有的靶基因的拷贝数不同，必要时可进行梯度稀释，确定最佳的DNA模板添加量。另外，2StepRT-PCR反应的cDNA（RT反应液）作为模板时的添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。-4-*3ROXReferenceDyeII（50×）比ROXR