生化检验基本知识-2

第二章生化检验实验室基本知识-2第三节检测系统的选择与评价第四节试剂盒的选择和评价检测系统的概念？实验方法选择的目的、原则和内容何谓决定性方法？参考方法？常规方法？推荐方法？各级实验方法与标准试剂应用的关系？系统误差和偶然误差的定义、特点和主要原因各种方法评价指标及其评价方法有哪些？思考题：第三节检测系统的选择与评价检测系统的概念：完成一个项目的测定所涉及的仪器、试剂、校准品、质控品、消耗品、操作程序、质量控制程序等的组合。即实验方法实验方法的选择是生化检验质控的基础，而方法学评价是方法选择的依据，由此可见，方法的选择与评价是全面质控工作中必不可少的重要环节。选择准确可靠的实验方法为临床提供准确可靠的信息临床生化检验分析实验方法选择的目的实验方法的分级标准试剂的分级保证一、实验方法的选择目的？选择精密度和准确度符合临床要求，快速，操作简便，成本低的检测手段。（一）实验方法选择的目的和原则原则?1.实用性包括微量快速，便于急诊、费用低廉、应用安全。2.可靠性有较高的精密度、准确度和较大的检测能力。（二）实验方法的分级分级依据：IFCC根据分析方法的准确性与精密度的不同。决定性方法参考方法常规方法分为三级：IFCC：国际临床化学联合会71、决定性方法definitivemethod定义：是指准确度最高，系统误差最小，经过详细的研究，没有发现产生误差的原因或在某些方面不够明确的方法，其测定结果与真值最为接近。主要方法：重量分析法、中子活化法、同位素稀释-质谱分析法（ID-MS）应用：由于技术要求太高，费用昂贵，只用于评价参考方法与一级标准品。这类方法不直接用于鉴定常规方法的准确性，82、参考方法referencemethod定义：是指准确度与精密度已经被充分证实，且经公认的权威机构（国家主管部门、相关学术团体和国际性组织等）颁布的方法。这类方法干扰因素少，系统误差很小，有适当的灵敏度、特异度、较宽的分析范围并且线性良好，重复测定中的随机误差可以忽略不计。主要方法：原子吸收分光光度法、火焰光度法、免疫化学法，离子交换层析法等应用：能在条件优越的实验室作常规分析，主要用于评价常规方法；鉴定二级标准品和为质控血清定值；用于商品试剂盒的质量评价。93、常规方法（routinemethod）定义：应具有足够的精密度、准确度和特异度，有适当的分析范围，经济实用，其性能指标符合临床或其它目的的需要。主要方法：分光光度法、离子选择电极法等。应用：临床常规检验使用，常规方法在作出评定以后，经有关学术组织认可，可以作为推荐方法（recommendedmethod）。10项目决定性方法参考方法钙ID-MS原子吸收分光光度法氯电量滴定法、中子活化法电流滴定法镁ID-MS原子吸收分光光度法磷ID-MS钾ID-MS、中子活化法火焰光度法钠重量分析法、中子活化法火焰光度法白蛋白免疫化学法总蛋白双缩脲法肌酐ID-MS、离子交换层析法离子交换层析法尿素ID-MS尿素酶法尿酸ID-MS尿酸酶法（紫外法）胆红素——重氮反应法葡萄糖ID-MS己糖激酶法胆固醇ID-MSAbell-Kendall法，胆固醇氧化酶法甘油三酯ID-MS酶法AST（GOT）——MDH-NADH法ALT（GPT）——LDH-NADH法转肽酶（r-GT）——连续监测产物生成法肌酸激酶——NAD+偶联法11（三）标准试剂的分级标准试剂（标准品）的定义：国际标准化委员会将标准品（参考物，referencematerial）的定义暂定为：它的一种或几种物理或化学性质已经充分确定；被用于校正仪器或用于评价一种测定方法的物质，并将其分成三级。标准品的应用：方法评价、仪器校正、常规分析的质量控制标准品的分级：一级标准品二级标准品控制物121、一级标准品（原级参考物）定义：是已经确定的稳定而均一的物质，其数值已由决定性方法确定或由高度准确的若干方法确定，所含杂质已经定量。应用：用于校正决定性方法，评价和校正参考方法以及为“二级标准品”定值。132、二级标准品（次级参考物）定义：这类标准品可以是纯溶液（水或有机溶剂的溶液），也可以存在于相似基质中。可由实验室自己配制或为商品，其中有关物质的量由参考方法定值或用一级标准品比较而确定。应用：主要用于常规方法的评价和控制物的定值。143、控制物（质控物）用二级标准品和常规方法测定，用于常规质量控制，以控制病人标本的测定误差。控制物不能用于标定仪器或方法。定值血清：在发生问题时查找原因未定值血清：一般情况下使用校准品：用二级标准品和常规方法定值，经过修正后的质控物。决定性方法一级标准品参考方法二级标准品常规方法控制物各级实验方法与标准试剂应用的关系1、选择方法需考虑下列三个方面内容方法学特性包括化学反应原理、最适反应条件、标化方法及分析操作的严密性等。工作特性包括分析测定范围（线性或工作范围）、精密度、回收率、干扰、准确度及检出限度等。应用特性包括实用性、成本费用、标本来源与种类、样品用量、分析速度，对设备条件与操作技术要求，方法的安全性。（四）实验方法选择的内容和步骤一般化验室主要选择常规方法或使用方便的参考方法。（1）广泛查阅文献根据方法选择的要求对各种方法进行比较，了解各方法的科学依据和使用价值。（2）选定候选方法根据本实验室的设备条件、人员素质、工作量等具体情况，选择合适的方法。（3）候选方法的初步评价实验包括?①标准曲线和重复性；②质控血清和标本的重复试验；③用不同浓度的标本与参考方法的结果对比。2、实验方法选择的步骤实验方法评价的过程就是对实验误差的测定。根据评价实验的结果和方法性能判断的标准，决定该方法是否可以被接受。二、实验方法的评价1、实验误差：是指给出值（包括测定值和标称值）与客观真值的之差。（一）实验误差及分类2、实验误差的分类(一)实验误差的分类:依据来源性质实验误差系统误差SE随机误差RE恒定系统误差CE比例系统误差PE（1）系统误差——表示不准确度定义：指一系列测定结果与真值有同一倾向的偏离。特点：由恒定的原因引起，具有单向性，在一定条件下重复出现，可校正。又分为恒定误差（CE）和比例误差（PE）。恒定误差：是指由干扰物引起的使测定值与真值存在恒定大小的误差。误差大小与被测物浓度无关，而与干扰物浓度相关。比例误差：是指相对于被测物浓度有相同的百分比误差，误差的绝对量与被测物浓度呈正比。引起误差的原因：①方法误差：最严重，最难避免；②仪器和试剂误差：可以采取措施避免。（2）偶然误差（随机误差）：定义：是指在实际工作中，多次重复测定某一物质时引起的误差。特点:①误差没有一定的大小和方向，可正可负，数据呈正态分布；②具有不可预测性，不可避兔，但可控制在一定范围内；③当分析步骤越多，造成种误差的机会越多；④随测定次数增加，其算术均数就越接近于真值。由测定仪器、试剂、环境等实验条件的改变以及分析人员操作习惯等因素的变化而引起。引起误差的原因：223、实验误差的表示方法：平均误差：算术平均偏差，用dm表示标准偏差（标准差）：表示精密度的较好的指标。绝对误差和绝对偏差：dm=Σ｜di｜/n=Σ｜X-｜/nXΣdi2=N-1绝对误差=X-T绝对偏差=X-X相对误差和相对偏差：变异系数（coefficientofvariation，CV）相对误差=X-TT×100%相对偏差=X-XX×100%CV=SX×100比较各组数据间的变异情况CV离散度精密度（二）方法评价的步骤和方法（1）评价前实验研究候选方法的最适条件。包括试剂浓度、缓冲液的种类、离子强度和pH值、反应的温度和时间、检测波长等。（2）初步评价包括批内和日内重复性试验、回收试验、干扰试验等。（3）最后评价包括日间重复性试验、方法比较试验和总体判断方法是否可接受。（4）评价后实验进行临床相关研究，包括参考值确定和特殊病人标本的测定等。（5）方法应用建立质控系统，培训操作者，引入常规工作等。1、实验方法评价的步骤实验误差类型与方法评价实验的关系？分析误差的类型评价实验初步实验最后实验随机误差（RE）批内重复实验日间重复实验恒定误差（CE）干扰实验方法比较实验比例误差（PE）回收实验方法比较实验1.精密度是指对同一样品多次测定，每次测定结果与均值的符合程度。是表示测定结果中随机误差大小的指标。精密度有批内、日内和日间的精密度之分，表示精密度的指标有标准差（s）、变异系数（CV）、标准误、平均偏差等。评价的方法：平行试验和重复性试验。（三）方法评价指标(有哪些?评价方法?)2.准确度指测定值与真值之间的符合程度。一般用偏差和偏差系数表示。准确度没有度量指标，往往以不准确度来衡量，即重复测定的均值与真值之差。准确度主要受系统误差支配，也受随机误差的影响。评价方法：回收试验、干扰实验、对比试验。3.线性范围是指实验方法所能检测标本中某物质的浓度范围。通过线性试验确定。1、重复性试验目的：是考察候选方法的随机误差，评价方法的精密度。分为：批内重复性试验，日内重复性试验和日间重复性试验批内重复性试验:方法：在很短的时间内对同一样品进行重复（一般为20次），计算、S、CV，(CV一般应小于5%)。目的：检测随机误差，衡量分析方法的精密度。X（四）评价试验X注意事项：（1）吸量要准确。所用吸管应校正并按正规要求操作。（2）被测物的浓度应选择有意义的医学决定水平，同时应在该方法的线性范围内。（3）一般宜使用高、中、低不同浓度标准液或混合血清。（4）计算变异系数时，应先剔除离群点后再计算。（方法见实验讲义51页）2、回收试验目的：是检测比例误差，以衡量分析方法的准确度。方法：是在样品中加入一定量被测物质，然后用同样方法测定，测得值与理论值之比乘以100%即为回收率，合格的回收率应为100%±5%。计算：回收浓度＝分析标本测得浓度－基础标本测得浓度加入浓度＝×标准液浓度标准液量（ml）病人样品量＋标准液量（ml）回收率（%）＝×100回收浓度加入浓度注意事项：（1）吸量要准确。所用吸管应校正并按正规要求操作。（2）加入标准液后的浓度应达到医学决定水平，同时应在该方法的线性范围内。（3）加入标准液的体积应在总体积的10%以内。（4）一般应做高、中、低不同浓度标准液的回收试验，计算平均回收率。（5）为了减少随机误差对检测比例误差的干扰，最好能重复测定2～3次。举例某法测定血糖回收率的标本制备和测定结果如下：（1）样本制备：①基础样本：血清2ml＋蒸馏水0.1ml②分析样本1：血清2ml＋25mmol/L葡萄糖标准液0.1ml。③分析样本2：血清2ml＋100mmol/L葡萄糖标准液0.1ml。（2）按操作要求测定上述样本，将结果填入下表血糖回收试验结果测定浓度加入浓度回收浓度回收率%基础样本5.50－－－分析样本16.751.191.25105.0分析样本210.204.764.7099.4回收率的理想值为100%，现在的平均回收率为102.2%，比例误差为2.2%，表明当一个标本的葡萄糖浓度为5.5mmol/L时，用该法测定值为5.62mmol/L，误差为0.12mmol/L（5.5mmol/L×2.2%）。一般要求回收率在95％～105％之间。平均回收率＝×100%＝102.2%105＋99.423、干扰试验目的：是检测恒定误差，以衡量方法的特异性和准确度。干扰物与分析试剂反应是特异性差，若不与试剂反应却影响测定值是干扰（准确度差）。方法：选混合血清标本，分成两份，其中一份标本中加入疑有干扰作用的物质。用候选方法对未加干扰物和加入干扰物的两种标本同时测定，两者之差即表示该干扰物产生的干扰所引起的误差，即干扰值。干扰值＝分析标本测得值－基础标本测得值注意事项：（1）被试验的物质根据方法的原理，提出可能的干扰物。一般应考虑的因素是胆红素、溶血、脂血、抗凝剂等。（2）可疑干扰物的浓度加入可疑干扰物的浓度须达到有价值的范围，有可能应达到病理标本的最高浓度值，在确证有影响后，应测定在何浓度时所产生的误差在临床上无意义（最低干扰浓度）。（3）本试验检测的误差包括方