组织切片制作

组织切片技术概述制片方法的种类：非切片法、切片法制片方法的一般步骤：切片法（1）杀死、取材与固定（2）洗涤（3）脱水（4）透明（5）透入（6）包埋（7）切片（8）贴片（9）染色（10）封藏非切片法（1）整体封藏法（2）涂片法（3）磨片法（4）分离法（浸渍分离法、撕碎法）（5）压碎法石蜡切片技术石蜡切片法是将组织经过一系列药品处理，使石蜡渗入组织，包埋成蜡块，再把组织蜡块切成极薄的片子，根据不同的需要用不同的染色方法以显示不同细胞和组织的形态，以及细胞和组织中某些化学或特殊（如抗原）成份含量的变化。一、取材取材应注意事项：1切取组织应根据需要观察的部位进行选择。所取组织应包括脏器或组织的重要结构或全层，同时考虑好切面方向。病理组织除切取病变部位外，还要切取病变和正常组织交界区域，以利观察分析。2切取的组织必须新鲜。取材后立即投入固定液中，否则组织会收缩变形，发生自溶现象。3切取组织，刀要锋利，动作要轻，不可来回切割，也不要挤压或牵拉组织，以免组织变形或内部细胞结构受损伤而发生变化。4切取的组织块必须小而薄。组织块的大小一般为0.5×0.5×0.2cm、1×1×0.3cm或1.5×1.5×0.3~0.5cm，最厚不能超过0.5cm。另：柔嫩组织、被膜厚而坚实的器官、小动物的器官及组织5采取消化道组织时应保持清洁。6防止材料因固定剂的作用而发生变形。如：柔嫩、薄的材料，有空气的组织7、组织块附加标记的方法采取的不同组织块，必须根据切片的要求和需要分瓶放入进行固定，加标签以示区别，并注明固定液、名称、来源、日期等等。二、固定固定就是将采取的新鲜组织，放入固定液内，借助化学药品的作用使细胞内的蛋白质、脂肪、糖、酶等各种成份沉淀保存下来。同时，使组织硬化不变形，有利于固定以后的处理。2固定时间应根据组织的种类、性质、大小，固定液的种类、性质、渗透力的强弱而定。如：一般组织，以10％福尔马林固定24h左右，波音(Bouin)氏固定液12至24h，卡诺氏(Carnoy)固定液1h内。适当地增加温度可缩短固定时间。1固定液的用量应充足，一般为组织块体积的10倍左右。3常用固定液（1）单纯固定液福尔马林固定液：甲醛10ml蒸馏水90ml优点：透渗能力强，固定均匀，组织收缩小。缺点：但经乙醇脱水后收缩较大。酒精固定液：无水乙醇（纯酒精）85ml（或95ml）蒸馏水15ml（或5ml）除此之外，还有重铬酸钾、苦味酸、升汞、醋酸、丙酮等单纯固定液。优点：有固定兼脱水作用，固定后可直接放入85％－95％酒精中脱水。对糖原、纤维蛋白和弹性纤维等固定效果好。缺点：但固定速度较慢，易使组织变脆。一般先用85％酒精固定数小时再放入95％酒精继续固定。（２）混合固定液波音(Bouin)氏固定液：饱和苦味酸水溶液75ml甲醛75ml冰醋酸5ml渗透迅速，固定均匀，组织收缩小，切片着色良好。卡诺氏(Carnoy)固定液：无水乙醇60ml三氯甲烷（氯仿）30ml冰醋酸10ml固定速度快，可固定细胞浆和细胞核，尤其适宜染色体的固定.中性福尔马林固定液甲醛100ml蒸馏水900ml磷酸二氢钠4g磷酸氢二钠6.5g渗透性好，组织收缩小，固定效果好。此外，还有辛克(Zenker)氏液、酒精福尔马林液(A·F·)等混合固定液。三、洗涤（或水洗）目的：组织在固定后要把渗入里面的固定液洗去，否则留在组织中的固定液有的会妨碍染色，有的会产生沉淀或结晶。原则：1、固定液为酒精或酒精混合液，一般不冲洗。2、固定液为甲醛水溶液或以水配制的可用流水冲洗。3、冲洗的时间与组织的种类，组织块大小和固定时间长短有关。一般10-24h。方法：流水缓慢冲洗。小组织可不冲洗，多次换水浸泡即可。四脱水组织经固定和水洗后含多量水分，水与透明剂、石蜡不能溶合，因此，在透明、浸蜡前必须进行脱水，把组织中的水份彻底驱除。常用脱水剂：酒精注意事项：1、一般从70％酒精开始，由低浓度酒精到高浓度酒精逐步递增。如果固定液为酒精溶液，则应从与固定液中相同浓度的酒精开始脱水。2、对一些柔软组织低等无脊椎动物组织需增加酒精级数，缩小浓度差异，应从70％酒精以下50％或30％开始脱水，否则收缩较大。3、脱水的时间根据组织的种类、体积大小和厚度而定，一般与组织的大小成正比。4、脱水必须在有盖瓶子内进行。酒精浓度脱水时间45~50℃恒温箱中脱水时间70％2~4h30~40min80%2~4h30~40min90%或95%2~4h1h无水乙醇I2h1h无水乙醇II2h1h一般组织酒精脱水的浓度及时间如下：五、透明为使石蜡能浸入组织块，组织脱水后，必须经过一种既能与酒精相混合，又能溶解石蜡的溶剂，通过这种溶剂的媒介作用，而达到石蜡浸入组织块的目的。常用透明剂：二甲苯注意事项：1、组织不能在二甲苯透明过久，在时间上应加以控制。2、组织在入二甲苯透明前最好先放入纯酒精与二甲苯等量混合液中半小时至1小时处理。3、二甲苯透明，一般15至30分钟，其间需更换一次二甲苯。4、对着光线观察组织呈半透明或透明状态即可。六浸蜡组织透明后，放入熔化的石蜡内浸渍，使石蜡渗入组织同时取代组织内的二甲苯，这个过程称浸蜡。注意事项：1、夏季：采用熔点高的石蜡（56－60℃）；冬季，应用熔点略低一点的石蜡（52－54℃）。一般常用石蜡熔点为52－60℃。2、浸蜡前可在石蜡二甲苯等量混合液内处理半小时至1小时。3、浸蜡温度（恒温箱温度）：比石蜡的熔点高2℃。4、浸蜡时间：3至5小时，其间更换一次石蜡。七、包埋包埋器蜡块步骤：将熔化好的石蜡倒入包埋框，用加温的镊子将组织块切面朝下放入，将准备好的标签放在待凝固的石蜡面上，冷却。完全凝固后，修整蜡块。包埋温度：与浸蜡的温度接近或高2℃左右。八、切片和附贴组织经石蜡包埋后制成的蜡块，用切片机切成薄片的过程称切片。1切片前的准备（1）切片前必须了解切片机的基本结构和性能。装刀架、刀片。检验刀片是否锋利。（2）载玻片、盖玻片的处理：洗液浸泡24小时后用自来水充分洗涤，95％酒精中浸泡，再用软绸布或纱布擦干待用。（3）为了使切出的薄片能粘贴在载玻片上，可用蛋清与甘油（1:1）混合物均匀抹在载玻片上，再使切片附贴在玻片上。（4）另外，准备水浴锅、蓬松的中号毛笔，眼科镊，水槽等物。2切片制作过程（1）冷冻组织蜡块，固定刀架、刀片和蜡块。（2）切片：切片厚度：5μm；转速：40至50次/分钟。（3）展片（4）捞片、烫片（45o）、捞片（5）切片过程中，固定好蜡块、刀片，注意刀与蜡块的角度（5o）。出现蜡片上卷、裂隙、刀痕等立即移动刀片或切片刀，换至刀刃锋利处。毛笔必须由下向上拔动，烫片时水温不宜过高等等。载玻片九、烤片40℃需烤1天或1昼夜；60℃烤0.5至1小时，放在酒精灯上烤片（必须来回晃动），或70℃左右的温度烤片，只需3至5分钟即可。十、染色1苏木精（素）－伊红染色方法具体步骤：（1）二甲苯I（10min）（2）二甲苯II（5min）（3）无水乙醇（1min）（4）95％酒精（1min）（5）85％酒精（1min）（6）75％酒精（1min）（7）自来水洗（2min）（8）苏木精染液（5－10min）（9）自来水洗（1－5min）（10）1％盐酸酒精（3－15s）（11）自来水洗（0.5h以上）（或自来水洗1min，0.5％左右的稀氨水返蓝1min，再水洗1min）（12）伊红染液（0.5－1min）（13）自来水洗（0.5－1min）（14）85％酒精（1min）（15）95％酒精（1min）（16）无水乙醇I（2min）（17）无水乙醇II（2min）（18）二甲苯I（2－3min）（19）二甲苯II（2－3min）染色结果：细胞核蓝色，细胞浆、肌肉、结缔组织、红细胞等呈不同程度的红色。切片应该是红蓝相映，色彩鲜明。2苏木精（素）－伊红染色液的配制（1）Harris苏木素染液的配制：苏木色精1g硫酸铝钾20g无水乙醇10ml蒸馏水200ml氧化汞0.5g（2）伊红（曙红）酒精染液的配制：曙红Y0.5－1g85％酒精100ml（3）1％的盐酸酒精溶液：85％酒精100ml内加入1ml盐酸。HE染色、封固后的切片载玻片盖玻片组织标本十一、封固切片经染色透明后，取出切片，擦去多余二甲苯，滴一滴中性树胶，将盖玻片复盖于切片上。贴上标签注明名称、编号。