实验二-PCR扩增及其产物的纯化

实验二PCR扩增实验三PCR产物的纯化实验目的和要求学习和掌握PCR基因扩增的原理和操作方法;学习和掌握从PCR产物中回收DNA片段的方法,并了解从琼脂糖凝胶中纯化DNA片段的有关技术.实验原理多聚酶链式反应(PolymeraseChainReaction,PCR)原理类似于DNA的变性和复性过程，即在高温（93-95℃）下，待扩增的靶DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板；而后在低温（37～65℃）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链；在Taq酶的最适温度（72℃）下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。每一双链的DNA模板，经过一次解链、退火、延伸三个步骤的热循环后就成了两条双链DNA分子。如此反复进行，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的指数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍。PCR反应系统的组成引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶、模板DNA、缓冲液。PCR仪、灭菌的微量离心管、凝胶电泳系统、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪等。材料与试剂实验步骤PCR反应体系（每人３小管）模板DNA0.5ul(10ng)引物10.2ul(10uM)引物20.2ul(10uM)dNTPs1ul(1mM)TaqDNA聚合酶0.2ul(5U/ul)10×缓冲液(Mg2+)3ul去离子水25ul总反应体系30ul94℃变性5min后，开始以下循环：94℃变性反应40s55℃退火反应30s72℃延伸反应1min最后72℃反应2min3２个循环PCR反应条件PCR产物电泳检测PCR产物分析取5ulPCR产物，采用1％琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物的量、引物扩增的特异性。并可根据标准DNA的量粗略计算PCR产物的总量。学生PCR实验结果A.从PCR产物中直接回收纯化DNA(Promega公司)1)直接加100μl纯化缓冲液于1.5ml离心管，再加入30～300μlPCR反应物；2)进入C步骤。回收PCR产物常采用两种方法，即直接回收和从凝胶中回收，目前有许多公司出售相关的试剂盒。DNA回收纯化B.从琼脂糖凝胶回收纯化DNA1)用琼脂糖凝胶分离PCR片段，用UV观察EB染色条带；2)用干净的刀片切出所需DNA条带，注意要在长波长（≥300nm）UV灯下操作，并快速操作，以免损伤DNA。应尽可能多地去除琼脂糖凝胶，一次操作可切取多至300mg的条带；3)将300μl(300mg)琼脂糖条带转移至1.5ml离心管。直接在65℃温育直至凝胶全部溶化（一般可按公司提供的说明书进行）；4)加等体积的溶液BE；5)下接C步骤。C.纯化步骤1)将PCR产物转移至一个1.5ml的离心管，向其中加入等体积溶液BD，混合均匀。2)将步骤1所获溶液置于DNA纯化柱中，静置2min。3)12000rpm离心1min，弃滤液。此时DNA片段被吸附于DNA纯化柱中的硅胶膜上4)加入500μl溶液PE。12000rpm，离心1min，弃滤液。洗脱硅胶上吸附的蛋白、盐等杂质洗脱，以获取高质量的DNA片段5)加入500μl溶液PE。12000rpm，离心1min，弃滤液。6)12000rpm离心3min，以彻底去除纯化柱中的液体。去除残留乙醇，避免乙醇影响后续酶促反应，同时也有利于DNA的充分溶解7)将离心柱置于新的1.5ml离心管。向纯化柱的中央处，悬空滴加15μl溶Ｅluent(60℃预热)，静置２min．12000rpm离心1min，管底即为目的DNA片段。贮存于-20℃备用。学生PCR实验结果(4l)PCR产物纯化后(相当于0.8l原PCR产物）PCR纯化并酶切后(2l)3kb=62.5ng1kb=21.0ng作业分析并讨论PCR扩增结果与纯化后结果11醉翁亭记1．反复朗读并背诵课文，培养文言语感。2．结合注释疏通文义，了解文本内容，掌握文本写作思路。3．把握文章的艺术特色，理解虚词在文中的作用。4．体会作者的思想感情，理解作者的政治理想。一、导入新课范仲淹因参与改革被贬，于庆历六年写下《岳阳楼记》，寄托自己“先天下之忧而忧，后天下之乐而乐”的政治理想。实际上，这次改革，受到贬谪的除了范仲淹和滕子京之外，还有范仲淹改革的另一位支持者——北宋大文学家、史学家欧阳修。他于庆历五年被贬谪到滁州，也就是今天的安徽省滁州市。也是在此期间，欧阳修在滁州留下了不逊于《岳阳楼记》的千古名篇——《醉翁亭记》。接下来就让我们一起来学习这篇课文吧！【教学提示】结合前文教学，有利于学生把握本文写作背景，进而加深学生对作品含义的理解。二、教学新课目标导学一：认识作者，了解作品背景作者简介：欧阳修(1007—1072)，字永叔，自号醉翁，晚年又号“六一居士”。吉州永丰(今属江西)人，因吉州原属庐陵郡，因此他又以“庐陵欧阳修”自居。谥号文忠，世称欧阳文忠公。北宋政治家、文学家、史学家，与韩愈、柳宗元、王安石、苏洵、苏轼、苏辙、曾巩合称“唐宋八大家”。后人又将其与韩愈、柳宗元和苏轼合称“千古文章四大家”。关于“醉翁”与“六一居士”：初谪滁山，自号醉翁。既老而衰且病，将退休于颍水之上，则又更号六一居士。客有问曰：“六一何谓也？”居士曰：“吾家藏书一万卷，集录三代以来金石遗文一千卷，有琴一张，有棋一局，而常置酒一壶。”客曰：“是为五一尔，奈何？”居士曰：“以吾一翁，老于此五物之间，岂不为六一乎？”写作背景：宋仁宗庆历五年(1045年)，参知政事范仲淹等人遭谗离职，欧阳修上书替他们分辩，被贬到滁州做了两年知州。到任以后，他内心抑郁，但还能发挥“宽简而不扰”的作风，取得了某些政绩。《醉翁亭记》就是在这个时期写就的。目标导学二：朗读文章，通文顺字1．初读文章，结合工具书梳理文章字词。2．朗读文章，划分文章节奏，标出节奏划分有疑难的语句。节奏划分示例环滁/皆山也。其/西南诸峰，林壑/尤美，望之/蔚然而深秀者，琅琊也。山行/六七里，渐闻/水声潺潺，而泻出于/两峰之间者，酿泉也。峰回/路转，有亭/翼然临于泉上者，醉翁亭也。作亭者/谁？山之僧/曰/智仙也。名之者/谁？太守/自谓也。太守与客来饮/于此，饮少/辄醉，而/年又最高，故/自号曰/醉翁也。醉翁之意/不在酒，在乎/山水之间也。山水之乐，得之心/而寓之酒也。节奏划分思考“山行/六七里”为什么不能划分为“山/行六七里”？明确：“山行”意指“沿着山路走”，“山行”是个状中短语，不能将其割裂。“望之/蔚然而深秀者”为什么不能划分为“望之蔚然/而深秀者”？明确：“蔚然而深秀”是两个并列的词，不宜割裂，“望之”是总起词语，故应从其后断句。【教学提示】引导学生在反复朗读的过程中划分朗读节奏，在划分节奏的过程中感知文意。对于部分结构复杂的句子，教师可做适当的讲解引导。目标导学三：结合注释，翻译训练1．学生结合课下注释和工具书自行疏通文义，并画出不解之处。【教学提示】节奏划分与明确文意相辅相成，若能以节奏划分引导学生明确文意最好；若学生理解有限，亦可在解读文意后把握节奏划分。2．以四人小组为单位，组内互助解疑，并尝试用“直译”与“意译”两种方法译读文章。3．教师选择疑难句或值得翻译的句子，请学生用两种翻译方法进行翻译。翻译示例：若夫日出而林霏开，云归而岩穴暝，晦明变化者，山间之朝暮也。野芳发而幽香，佳木秀而繁阴，风霜高洁，水落而石出者，山间之四时也。直译法：那太阳一出来，树林里的雾气散开，云雾聚拢，山谷就显得昏暗了，朝则自暗而明，暮则自明而暗，或暗或明，变化不一，这是山间早晚的景色。野花开放，有一股清幽的香味，好的树木枝叶繁茂，形成浓郁的绿荫。天高气爽，霜色洁白，泉水浅了，石底露出水面，这是山中四季的景色。意译法：太阳升起，山林里雾气开始消散，烟云聚拢，山谷又开始显得昏暗，清晨自暗而明，薄暮又自明而暗，如此暗明变化的，就是山中的朝暮。春天野花绽开并散发出阵阵幽香，夏日佳树繁茂并形成一片浓荫，秋天风高气爽，霜色洁白，冬日水枯而石底上露，如此，就是山中的四季。【教学提示】翻译有直译与意译两种方式，直译锻炼学生用语的准确性，但可能会降低译文的美感；意译可加强译文的美感，培养学生的翻译兴趣，但可能会降低译文的准确性。因此，需两种翻译方式都做必要引导。全文直译内容见《我的积累本》。目标导学四：解读文段，把握文本内容1．赏析第一段，说说本文是如何引出“醉翁亭”的位置的，作者在此运用了怎样的艺术手法。明确：首先以“环滁皆山也”五字领起，将滁州的地理环境一笔勾出，点出醉翁亭坐落在群山之中，并纵观滁州全貌，鸟瞰群山环抱之景。接着作者将“镜头”全景移向局部，先写“西南诸峰，林壑尤美”，醉翁亭坐落在有最美的林壑的西南诸峰之中，视野集中到最佳处。再写琅琊山“蔚然而深秀”，点山“秀”，照应上文的“美”。又写酿泉，其名字透出了泉与酒的关系，好泉酿好酒，好酒叫人醉。“醉翁亭”的名字便暗中透出，然后引出“醉翁亭”来。作者利用空间变幻的手法，移步换景，由远及近，为我们描绘了一幅幅山水特写。2．第二段主要写了什么？它和第一段有什么联系？明确：第二段利用时间推移，抓住朝暮及四季特点，描绘了对比鲜明的晦明变化图及四季风光图，写出了其中的“乐亦无穷”。第二段是第一段“山水之乐”的具体化。3．第三段同样是写“乐”，但却是写的游人之乐，作者是如何写游人之乐的？明确：“滁人游”，前呼后应，扶老携幼，自由自在，热闹非凡；“太守宴”，溪深鱼肥，泉香酒洌，美味佳肴，应有尽有；“众宾欢”，投壶下棋，觥筹交错，说说笑笑，无拘无束。如此勾画了游人之乐。4．作者为什么要在第三段写游人之乐？明确：写滁人之游，描绘出一幅太平祥和的百姓游乐图。游乐场景映在太守的眼里，便多了一层政治清明的意味。太守在游人之乐中酒酣而醉，此醉是为山水之乐而醉，更是为能与百姓同乐而醉。体现太守与百姓关系融洽，“政通人和”才能有这样的乐。5．第四段主要写了什么？明确：写宴会散、众人归的情景。目标导学五：深入解读，把握作者思想感情思考探究：作者以一个“乐”字贯穿全篇，却有两个句子别出深意，不单单是在写乐，而是另有所指，表达出另外一种情绪，请你找出这两个句子，说说这种情绪是什么。明确：醉翁之意不在酒，在乎山水之间也。醉能同其乐，醒能述以文者，太守也。这种情绪是作者遭贬谪后的抑郁，作者并未在文中袒露胸怀，只含蓄地说：“醉能同其乐，醒能述以文者，太守也。”此句与醉翁亭的名称、“醉翁之意不在酒，在乎山水之间也”前后呼应，并与“滁人游”“太守宴”“众宾欢”“太守醉”连成一条抒情的线索，曲折地表达了作者内心复杂的思想感情。目标导学六：赏析文本，感受文本艺术特色1．在把握作者复杂感情的基础上朗读文本。2．反复朗读，请同学说说本文读来有哪些特点，为什么会有这些特点。(1)句法上大量运用骈偶句，并夹有散句，既整齐又富有变化，使文章越发显得音调铿锵，形成一种骈散结合的独特风格。如“野芳发而幽香，佳木秀而繁阴”“朝而往，暮而归，四时之景不同，而乐亦无穷也”。(2)文章多用判断句，层次极其分明，抒情淋漓尽致，“也”“而”的反复运用，形成回环往复的韵律，使读者在诵读中获得美的享受。(3)文章写景优美，又多韵律，使人读来不仅能感受到绘画美，也能感受到韵律美。目标导学七：探索文本虚词，把握文言现象虚词“而”的用法用法文本举例表并列1.蔚然而深秀者；2.溪深而鱼肥；3.泉香而酒洌；4.起坐而喧哗者表递进1.而年又最高；2.得之心而寓之酒也表承接1.渐闻水声潺潺，而泻出于两峰之间者；2.若夫日出而林霏开，云归而岩穴暝；3.野芳发而幽香，佳木秀而繁阴；4.水落而石出者；5.临溪而渔；6.太守归而宾客从也；7.人知从太守游而乐表修饰1.朝而往，暮而归；2.杂然而前陈者表转折1.而不知人之乐；2.而不知太守之乐其乐也虚词“之”的用法用法文本举例表助词“的”1.泻出于两峰之间者；2.醉翁之意不在酒；3.山水之乐；4.山间之朝暮也；5.宴酣之乐位于主谓之间，取消句子独立性而不知太守之乐其乐也表代词