实验总结的几种高效酿酒酵母转化方法

电转法设计方案一：感受态制备：1.挑一环酵母菌接种于5mLYEPD培养基中，30℃、250-300rpm培养过夜；2.取1mL一级种子分别接种于两瓶50mLYEPD培养基中，30℃、250-300rpm培养约16-18h(OD:1.3-1.5)；3.于4℃离心收集菌体，用25mL冰无菌水洗涤一次后，细胞用10ml冰无菌水重悬，可换成较小的离心管；4.加入1ml，pH7.5，10×TE缓冲液，摇晃均匀，再加入1ml10×LiAc，旋转摇匀，于30度轻轻摇动45min；5.再加入0.4ml1mol/LDTT，并同时旋转摇动，于30度轻轻摇动15min；6.于4℃离心，弃上清（用枪吸），再用25mL冰无菌水洗涤；7.2.5ml冰冷的1mol/L山梨醇洗涤，离心收集菌体，弃上清（用枪吸）；8.每管用100ul山梨醇溶解，分装于EP管中（80ul/管），于-70℃冰箱保存。电转化：1．向感受态细胞中加入约5～10ug（体积小于10ul）的DNA，用枪吹吸均匀，转移至预冷的电转杯中，静置5min；2．擦干电转杯，电击，电击参数：1.5KV，25uF，200欧姆；3．立即加入1ml预冷的山梨醇，转移至EP管中，于30℃静置1h；4．离心，弃上清，加入1mLYEPD后，于30℃、200rpm培养2h；5．离心得菌体后，吸除550ul上清液，然后按150ul/板进行涂板。说明：该方法可直接采用50或100mL体系的一步法，即直接挑单菌落于YEPD中培养至预定菌浓，也可采用试管摇菌收集菌体制备感受态。设计方案二：感受态制备：1.挑一环酵母菌接种于5mLYEPD培养基中，30℃、250-300rpm培养过夜；2.取1mL一级种子分别接种于两瓶50mLYEPD培养基中，30℃、250-300rpm培养约16-18h(OD:1.3-1.5)；3.于4℃，5000rpm，5min离心收集菌体，用25mL冰无菌水洗涤后，细胞重悬于8ml处理液中（处理液配方：100mMLiAc，10mMDTT，0.6M山梨醇，10mMTris-HCl，pH7.5），室温静置30min；4.4℃，5000rpm，5min离心收集菌体，用1.5mL1mol/L预冷的山梨醇洗涤三次，离心条件一样；5.每管用100ul山梨醇溶解（以黄枪头能吸取为宜，菌浓低时可适量少加入山梨醇），最后以80ul的终体积转移至EP管中（菌体太多可适当放弃部分），置于-70℃冰箱保存。电转化：1.向感受态细胞中加入约3ug（体积小于10ul）的DNA，用枪吹吸均匀，转移至预冷的电转杯中，静置5min；2.擦干电转杯，电击，电击参数：2.0KV，25uF，200欧姆；3.立即加入1ml预冷的山梨醇，转移至EP管中，于30℃静置1h；4.离心，弃上清，加入1mLYEPD后，于30℃、200rpm培养2h；5.离心得菌体后，吸除550ul上清液，然后按150ul/板进行涂板。说明：处理液中的DTT是在使用前加入，其它配好后于4度保存，DTT单独于-20度保存，可配成100倍的贮备液。制备体系可按比例放大。设计方案二特别适合于采用一步法制备感受态细胞具体如下：1.挑一环酵母菌接种于5mLYEPD培养基中或转接于50mLYEPD中，在30℃、250-300rpm条件下培养至OD=6-10（为防止菌体老化，可将50mL培养体系提早收获细胞，取菌体时，以1mL/次，取菌两次或三次不等，使用菌浓达到预定的OD:6-10）；2.取1mL菌液分装于EP管中，于4℃，12000rpm离心30s，弃上清；3.收集菌体，用预冰的无菌水洗涤两次，离心条件一样；4.所得菌体用1mL处理液（配方同上）于室温下处理30min；5.离心，弃上清，加入1ml1M预冷山梨醇，离心，弃上清，重复两次；6.最终用1M预冷山梨醇溶解菌体至终体积为80ul，于-70℃冰箱保存；7.电转方法同上。8.每一步的离心均30s即可，在较短的时间内制备出的感受态转化效率特别高。备注：OD检测均为600nm，空白参比为：YEPD，高浓测定时应稀释测定。所有无菌水与山梨醇均在冰上预冷处理；在制备感受态阶段，所有离心均在4℃条件下。醋酸锂转化法方案一：1.挑一环酵母菌接种于5mLYEPD培养基中，30℃、200rpm培养过夜；2.取1mL一级种子分别接种于两瓶50mLYEPD培养基中，30℃、250-300rpm培养约5h(OD:0.5-0.8)；3.于4℃，5000rpm，5min离心收集菌体；4.25mL冰无菌水洗涤两次，离心条件一样；5.用1mL0.1MLiAc悬浮，离心收集菌体；6.再用0.5mL0.1MLiAc悬浮，以50ul/管分装于EP管中，置于冰上备用；7.依次向上述50ul感受态细胞中加入50%PEG3350：240ul、1MLiCl：36ul、2mg/ml单链DNA：50ul、转化DNA（5-10ug）：50ul；8.剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约1min）；9.30℃水浴孵育30min；10.42℃水浴热休克20～25min；11.13000rpm离心30s收集酵母菌体，重悬酵母于1mlYEPD培养基，30℃摇床孵育4h；12.离心收集沉淀菌体，取除约800ul上清液，然后按每100ul/板进行涨涂板。方案二：1、接种液体YEPD培养基，过夜培养至1-2×107cells/ml；2、取1mL一级种子分别接种于两瓶50mLYEPD培养基中，30℃、250-300rpm培养约5h(OD:0.5-0.8)；3、收集细胞，并用无菌水清洗，之后用1ml无菌水重悬，并转移到1.5ml离心管；4、1mlTE/LiAC（10×TE[0.1MTris-HCI,0.01MEDTA,pH7.5]；lO×LiAc[1MLiAcpH7.5）清洗细胞，然后用1×TE/LiAC重悬至2×109cells/ml；5、1.5ml离心管中取50u悬浮液，用1ug转化片段和50ug单链鲑鱼精DNA混合；6、加入300ul灭菌的40%PEG溶液，剧烈混匀；7、30度振荡培养30min；8、42度水浴热击15min；9、离心5s，用1ml1×TE重悬，适当稀释后涂布于选择培养基。附：电转法方案二中的处量液配制方法：1.A液成份：100mMLiAc，0.6M山梨醇，10mMTris-HCl，pH7.5；配制量：500mL。1.1称取54.654g山梨醇，用适量dd无菌水溶解于500mL容量瓶中；1.2事先配制1MLiAc母液，再从LiAc母液中取50mL至1.1所述容量瓶中；1.3事先配好1MTris-HCl（pH7.5），再取5mL至1.1所述容量瓶中；1.4用dd无菌水定量至500mL，转移至试剂瓶中，于4℃保存。2.B液成份（母液）：1MDTT配制量：20mL。2.1称取3.09gDTT，加入到50mL小烧杯内；2.2加入20mL的0.01MNaOAc(pH5.2)，溶解后使用0.22um滤器过滤除菌；2.3适量分成小份后，-20℃保存。3.在使用时按每50mL菌体量用8mL处理液（A+B）。以50mL菌体为例：取A液8mL，再取80ul1MDTT于小三角瓶中混匀，备用。