多糖的电泳和层析技术研究进展

多糖的电泳和层析技术多糖的化学性质多糖（polysaccharide）糖链高分子碳水化合物多糖：相同的单糖组成eg—淀粉、纤维素和糖原杂多糖：不同的单糖组成eg—阿拉伯胶和肝素1.一般不溶于水2.无甜味3.不能形成结晶4.无还原性和变旋现象多糖的药理作用polysaccharide抗肿瘤抗病毒降血糖抗炎抗补体电泳技术层析技术多糖的电泳技术多糖分子在一定pH值的缓冲体系中也会解离带电，带电的离子在电场的作用下向一定的方向泳动，电荷和分子大小决定了分子泳动速率，根据泳动速率的不同即可分离多糖。多糖研究中用到的电泳方法主要有纸电泳、醋酸纤维膜电泳、凝胶电泳、毛细管电泳四种。多糖电泳技术的原理多糖的电泳技术—纸电泳纸电泳原理纸电泳是根据电泳现象在渗透了缓冲液的纸上加上电场使物质移动的电泳技术，根据支持物材质不同可分为滤纸电泳和玻璃纤维纸电泳两种。电泳采用的缓冲液以硼酸盐较普遍，因糖类物质中的相邻羟基易与硼酸离子结合，生成硼酸复盐，增加了电导性。多糖的电泳技术—纸电泳滤纸电泳操作步骤8cm×24cm滤纸条载玻片线形点样400V电泳2小时乙醇固定高碘酸溶液70%乙酸溶液冲洗亚硫酸品红30min，糖处呈现紫红色玻璃纤维纸电泳操作步骤5cm×20cm玻璃纤维纸800V电泳40分钟自然晾干，茴香胺硫酸溶液喷雾染色100℃烘烤15分钟显棕黄色载玻片线形点样多糖的电泳技术—醋酸纤维膜电泳醋酸纤维膜电泳的原理醋酸纤维素膜电泳是以醋酸纤维素膜为介质，其电泳原理与纸电泳基本相同。醋酸纤维素是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而成，溶于丙酮后可涂布成均一的微孔薄膜，即醋酸纤维素膜。多糖的电泳技术—醋酸纤维膜电泳醋酸纤维膜电泳操作步骤2cm×8cm醋酸纤维薄膜缓冲液取出膜条夹在两层滤纸内吸去多余的缓冲液浸泡15min1mm×5mm薄膜浸渍样品溶液约1μL紧贴在离膜条一端2cm处点样250V，电泳20分钟晾干，甲苯胺蓝溶液染色90%的乙醇漂洗多糖处为蓝色色斑多糖的电泳技术—凝胶电泳凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳淀粉凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）凝胶电泳—聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）多糖的PAGE原理由于多糖的分子量较大，高分离胶的浓度才能使线性酸性多糖分子像球状蛋白分子一样在电场的作用下实现分离，因此分离胶浓度一般选用7.5%~8%。多糖复合物的解离程度较微弱，电荷密度低又具有糖单元不均一性、不对称性，以致多糖的电泳带中呈带状分布，带状越明显，说明多糖的单元成分和结构就越复杂。凝胶电泳—聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）判断海洋硫酸多糖相对分子量大小和分布情况1.配制缓冲液（1）分散缓冲液：硼酸3.09g，Tris6.15g，EDTA1.86g，加水溶解，定容至500ml（pH8.3）（2）上层缓冲液：甘氨酸46.92g，Tris12.12g，加水溶解，定容至500ml（3）分离胶缓冲液：丙烯酰胺10g，亚甲双丙烯酰胺1.0g，蔗糖7.5g，用pH8.3分散缓冲液溶解，定容至50ml（4）浓缩胶缓冲液：丙烯酰胺2.375g，亚甲双丙烯酰胺0.125g，溶于40ml分散缓冲液中，用0.1mol/L盐酸调pH6.3，定容至50ml2.制胶（1）分离胶缓冲液6ml、10%APS36μl、TEMED6μl制成分离胶（2）浓缩胶缓冲液2ml、10%APS60μl、TEMED2μl制成浓缩胶3.海洋硫酸多糖供试品上样CHS1、CHS2、DPS和GAS各上样6μg凝胶电泳—聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）200V、温度25℃电泳2小时0.5%的阿利新蓝溶液水脱色几种海洋硫酸多糖的PAGE电泳图谱均呈带状分布从而可看出其相对分子量呈连续分布1.CHS2；2.对照品肝素；3.低分子肝素；4.CHS1；5.DPS；6.GAS凝胶电泳—聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）谱图经图象扫描分析软件处理后可得到数字化图谱，求得CHS1、CHS2、DPS和GAS的相对分子量分布分别为3000~10000、6200~8200、4000~7400、3100~7700。凝胶电泳—琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳的原理多糖的琼脂糖凝胶电泳也是依据电荷密度和分子量差异进行分离，制胶浓度在0.5%~1.2%之间，上样量3~5μl（约含1~10μg多糖），电泳后用甲苯胺蓝溶液染色，值得注意的是，因甲苯胺蓝不易使中性糖染色，样品以酸性多糖为宜。几种多糖电泳技术的比较电泳技术电极缓冲液染色剂指示剂脱色剂滤纸电泳硼酸盐缓冲液（pH10.0）高碘酸西夫试剂+亚硫酸品红溶液无70%乙酸+亚硫酸盐冲洗液玻璃纤维纸电泳0.025mol/L硼酸盐缓冲液（pH10.2）p-茴香胺硫酸试剂无无醋酸纤维膜电泳硼酸盐缓冲液（pH12.5）0.5%甲苯胺蓝溶液无90%乙醇或1%醋酸聚丙烯酰胺凝胶电泳Tris-HCL缓冲液，pH9.1高碘酸西夫试剂、麝香草酚溶剂混合物或0.1%阿利新蓝溴酚蓝用阿利新蓝染色时用7%醋酸、0.6mol/HCL漂洗琼脂糖凝胶电泳0.06mol/L巴比妥缓冲液或0.05mol/L乙二胺缓冲液（pH8.5）0.1%甲苯胺蓝溶液无醋酸：乙醇：水=0.1:5:5其他多糖电泳技术毛细管电泳的原理毛细管电泳（CE）具有快速、高效和高灵敏度、所需样品少等特点。CE是以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间分配行为上的差异而实现分离的液相分离技术。毛细管电泳主要用于分析多糖中的单糖组分。其操作的一般过程为水解多糖样品，水解产物与混合标准多糖分别进行衍生化反应，然后取产物进入高效毛细管电泳分析，得出的样品图谱和标准图谱进行比对。另外两种常用的多糖电泳技术1mol/LH2SO41mL100℃封管水解10mgGBSP6小时，冷却后，3000r/min离心5min，取上清液，BaCO3中和5000r/min离心10min，取上清50μL待衍生。取样品上清50μL和标准单糖各10mg，加入40μL衍生剂，80℃衍生1小时，加500μL三氯甲烷及500μL双蒸水，混匀，6000r/min离心15分钟，取上清用于高效毛细管电泳分析。电泳缓冲液为pH10.2的50mmol/L硼砂缓冲液，电压16kV，毛细管：50μm（id）×27cm；UV：254nm。1.L-鼠李糖；2.葡萄糖；3.4-D-甘露糖；4.D-半乳糖；5.GBSP如银杏白果多糖（GBSP）的成分分析另外两种常用的多糖电泳技术等电聚焦电泳是PAGE电泳的一种特殊方法，以两性电解质为载体，在电场中逐步形成pH梯度，电泳时把具有兼性离子电解质的生物样品聚焦，达到等电状态相应有效pH梯度时，利用凝胶的抗对流作用使其不被扩散，达到分离目的。在多糖分离中针对的是酸性多糖样品，根据酸性多糖解离度不同而实现分离。等电聚焦电泳的原理多糖的层析技术层析技术是利用混合物中各组分的理化性质（吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、分配系数等）的差异，造成混合物中各组分距离不等的迁移，从而达到分离的目的。多糖研究中常用的有纸层析、柱层析。层析技术吸附力分子亲和力分配系数分子形状和大小分子极性多糖的层析技术—纸层析多糖经酸（硫酸或盐酸）水解成单糖，再进行纸层析（1）常用的溶剂系统粘多糖：0.067mol/L磷酸盐缓冲液（pH6.4）直链淀粉：75%异丙醇（V/V）：乙醇=9：1（V/V）（2）斑点的检出1）鉴定直链淀粉用苯胺一邻苯二甲酸试剂2）鉴定还原性多糖用Sornogyi试剂3）鉴定粘多糖用甲苯胺蓝试剂4）鉴定淀粉用1%碘乙醇溶液多糖的层析技术—柱层析纤维素柱层析阴离子交换柱层析凝胶柱层析亲和层析气相层析高效液相层析柱层析—纤维素柱层析纤维素柱层析中的载体是纤维素。先用乙醇液将柱内纤维素平衡好，然后多糖混合物沉淀于惰性的纤维素上面。用不同浓度乙醇水溶液（如80%，60%，40%，20%）阶梯洗脱，不同多糖就依次洗脱出来。先洗脱的是分子量最小的多糖，最终洗脱的是分子量最大的多糖。纤维素柱层析的原理柱层析—阴离子交换柱层析阴离子交换柱层析的原理阴离子交换柱层析适合于分离各种酸性、中性多糖及粘多糖，是目前多糖纯化中应用最普遍的一种方法，特别是对于体积较大的多糖溶液，大多首先采用阴离子交换柱层析进行浓缩及初步纯化柱层析—阴离子交换柱层析常用的阴离子交换剂DEAE-纤维素DEAE-葡聚糖DEAE-琼脂糖多糖的分离纯化×（1）流速过慢（2）柱床高度会随缓冲液浓度及pH的改变而改变（3）稳定性差（4）使用寿命短原因在于：化学稳定性好、流速快的SepharoseFF柱层析—阴离子交换柱层析DEAE-32纤维素柱层析分析虫草多糖组分DEAE-32纤维素层析柱的制备：DEAE-32纤维素粉→溶胀→漂洗3次→1mol/LNaOH浸泡4h→蒸馏水洗至中性→1mol/LHCl浸泡4h→蒸馏水洗至中性→重复3~5次→装柱→平衡→加样→洗脱（速度为5ml/10min）冬虫夏草胞外多糖蒸馏水洗脱曲线冬虫夏草胞内多糖蒸馏水洗脱曲线柱层析—凝胶柱层析一、葡聚糖凝胶(Sephadex)二、修饰葡聚糖凝胶(ModifiedSephadex)三、聚丙烯酰胺凝胶（Bio-GelP）四、琼脂糖类凝胶（Sepharose）五、多孔玻璃微球(Bio-glas)六、疏水性凝胶（hydrophobicgels）编号交联度吸液量膨胀速度凝胶孔径分离限凝胶强度SephadexG－150小大慢大大小SephadexG－50大小快小小大柱层析—亲和层析某些特定多糖具有和某些专一分子可逆结合的特性，如刀豆球蛋白能专一地与分支多糖结合。把ConA作为配基，与不溶性载体结合使其固定化，装入色谱柱（亲和柱），然后把含有欲分离的多糖溶液作流动相，这时溶液中只有能和配基具有亲和力的多糖分子被结合而吸附，其他多糖则流出柱外，然后再改变流动相的离子强度及pH，使配基与多糖解离，则实现了多糖的分离纯化优点效率高操作简单适合分离含量较少的多糖总结多糖结构的多样性及其引起的功能复杂性，给多糖的研究工作带来巨大的困难，多糖的分离纯化及分析鉴定的方法进展较为缓慢。对于一种多糖的分离纯化，需要综合运用不同的分离纯化技术，才能较全面地表征某种多糖的性质，进而获得高纯度的药用多糖成分。Thanks