细胞凋亡检测

三、细胞生长状况有关指标的检测方法细胞计数法细胞生长曲线细胞分裂指数克隆形成率1、细胞计数法细胞计数法是用血细胞计数板计数细胞悬液中的细胞数目，以测定细胞增殖和调整细胞浓度。台盼蓝染色法用于检测存活细胞数。注：台盼蓝染色——排除检测法，由于死细胞的细胞膜通透性发生改变，染料可大量进入却不能被排出，因而细胞被染色；而活细胞能拒染，因而不易着色。Trypanbluestainingofadultratcardiacmyocytesinprimaryculture.Livecellsexcludethebluedye,andsoappearclear.Deadcellstakeupthedyeandappearblue.结果分析•细胞密度细胞数/ml＝（4大格细胞数之和/4）×104×稀释倍数•细胞存活百分率细胞活力（％）＝未着色细胞数÷总细胞数×100％2、细胞生长曲线•细胞生长曲线是细胞培养实验中最基本的指标，是观察同一代细胞的增殖过程。根据细胞生长曲线分析细胞增殖•方法一：在同一规格的培养瓶中，接种同等量的同一代细胞，经培养后每隔24h取出几瓶细胞进行计数，以培养时间为横坐标，不同时刻的细胞数为纵坐标，即为该细胞的生长曲线。•方法二：四氮唑盐（MTT）比色法3、细胞分裂指数•细胞分裂指数是表示细胞增殖旺盛程度的指标；以被测1000个细胞中的分裂细胞数来计算。•方法：染色后血细胞计数板计数细胞分裂指数＝细胞分裂相数/细胞总数（1000）×100％4、克隆形成率•克隆形成率所计数的细胞必为贴壁和有增殖能力的细胞，反映细胞群体依赖性和增殖能力。•各种细胞克隆形成率差别很大，一般初代细胞克隆形成率弱，传代细胞系强；二倍体细胞克隆形成率弱，转化细胞系强；正常细胞克隆形成率弱，肿瘤细胞强。•方法克隆形成率＝克隆数/接种细胞数×100％•注意：细胞要分散好，不能有细胞团，接种密度不要过大。四、细胞生物活性的化学检测法•四氮唑盐（MTT）比色法•细胞蛋白质含量测定法•细胞蛋白质合成的3H-亮氨酸掺入试验•细胞DNA合成的3H-TdR掺入试验1、四氮唑盐（MTT）比色法•原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能将MTT黄色溶液还原成不溶性的蓝紫色结晶物，并沉积于细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）和酸化的异丙醇或酸化的SDS等均能溶解细胞中的紫蓝色结晶物，用酶联免疫检测仪，在490，570nm波长处测定其光吸收值（OD），可间接反映活细胞数量。在一定细胞数值范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。•此法已广泛用于生物活性因子的活性检测、细胞毒性实验、抗肿瘤药物筛选和肿瘤放射敏感性测定等。•操作步骤（1）单细胞悬液接种于96孔培养板；103-104细胞/孔，每孔培养基总量200μl,37℃、5％CO2培养箱中培养一段时间（根据实验目的决定培养时间）（2）加入2mg／ml的MTT液（50微升／孔）；继续培养3小时。（3）吸出孔内培养液后，加入DMSO液（150μl／孔），将培养板置于微孔板扳荡器上振荡10分钟，使结晶物溶解。（4）酶标仪检测各孔OD值（检测波长为490或570nm）。记录结果，绘制细胞生长曲线2、细胞蛋白质含量测定法（考马斯亮蓝测定法）•原理：考马斯亮蓝在酸性溶液与蛋白质结合后，在595nm波长处呈现最大吸收量，其吸光值与蛋白质含量呈正相关。•此法主要用于测定酶、受体及细胞外代谢产物特异性活性的度量单位。3、细胞蛋白质合成的3H-亮氨酸掺入实验原理：细胞在合成蛋白质时需摄取外源性氨基酸，用核素标记氨基酸，如3H-亮氨酸，可以掺入细胞蛋白质合成代谢中，通过测定细胞的放射性强度，可了解细胞蛋白质合成代谢状况。4、细胞DNA合成的3H-TdR掺入实验原理：胸腺嘧啶核苷（TdR）是DNA特有的碱基，也是DNA合成的必需物质。用核苷3H标记TdR即3H-TdR作为DNA合成的前体能掺入DNA合成代谢过程，通过测定细胞的放射性强度，可以反映细胞DNA的代谢及细胞增殖情况。五、细胞凋亡检测方法（一）、凋亡概念：细胞凋亡是细胞循自身程序结束其生命的主动死亡的过程，具有特征的形态和生化改变，是由基因控制的个别细胞发生的自主有序的死亡。即是由基因控制细胞有目的，有选择性的自我消亡过程，这种淘汰机制是保证生命进化的基础。a、凋亡概念的形成和形态学的研究(1972）1965年发育生物学家Lockshin在研究硪发育过程中首次提出程序化死亡（programmedcelldeath）概念。1971年澳大利亚生物学家Kerr用皱缩死亡来区别经典的细胞坏死。1972年Kerr等在英国癌症杂志发表论文，首次提出细胞凋亡(apotosis)的概念。宣告了对细胞凋亡的真正探索的开始。b、DNA的降解和内源性核酸内切酶的参与。(1987）c、蛋白质水解酶活化的研究(1995)d、细胞膜的变化(1997)e、线粒体的变化和分子生物学的研究(1998-)1)相关基因及调控2）信号转导3）各种分子及其相互作用及相互关系4）疾病机制的阐明，以及新疗法的探索及问世。（二）、凋亡的研究历史Science.2005Oct7;310(5745):66-7.似秋叶的凋零，告别生命之辉煌；那难以计数的攻击、诱导，轻启着道道程序，逼细胞步步走向生命的末端；啊，活性氧处处肆虐，钙波涛惊石裂岸，线粒体把生命之光一点一点拧淡;•危难中的细胞啊，•你沉稳不乱，•DNA片片切割，•化云梯直通天堂；•细胞体分团相聚，•把生命的凝重浓集在小体上；•分别了朝夕相处的伙伴，•再见了快乐美好的时光；•这一切的一切又融入临近的胞体，•腾出的空间再写生命的篇章。NormalApoptosisNecrosis（三）、凋亡与坏死凋亡与坏死主要鉴别（形态学）凋亡坏死细胞形态细胞膜出芽，冒泡但完整性好，活组织中个别细胞死亡细胞完整性破坏成片细胞死亡，破坏组织结构过程固缩核，浓染胞浆，脱离。凋亡小体细胞肿胀，核淡染，凝固性坏死，无膜性小体细胞器细胞器未遭破坏，胞浆浓缩细胞器肿胀溶解染色质染色质致密，凝集或边集浓染染色质疏松变性粗糙染料排斥试验开始被排斥染料掺入（膜破坏或通透性↑）DNA破坏机制核酸内切酶作用核酸DNA裂解为200bp或其倍数片断（核孔裂开）随机降解弥漫ATP膜损伤，氧自由基损伤结局凋亡小体可被同种或异种细胞识别吞噬吞噬细胞吞噬细胞碎片，溶解组织反应不引起炎症反应，迅速退化，无整个组织瓦解，不诱发组织的再生与修复，细胞生长增殖→凋亡引起炎症反应，继发性组织损伤，诱发组织再生与修复，形成疤痕，坏死→补偿性增生→细胞增殖接受凋亡信号凋亡调控分子间的相互作用蛋白水解酶（caspases）的活化凋亡的级联反应（四）、细胞凋亡的过程及机理凋亡主要信号途径Modelforcaspaseactivationbymitochondria.osmoticdisequilibriumleadingtoanexpansionofthematrixspace,organellarswelling,andsubsequentruptureoftheoutermembranetheotherenvisionsopeningofchannelsintheoutermembranethusreleasingcytocfromtheintermembranespaceofmitochondriaintothecytosol.Multipleapoptoticpathwaysemanatefromthemitochondria.chromatincondensationandfragmentation（五）、细胞凋亡的检测方法细胞凋亡的形态学检测磷脂酰丝氨酸外翻分析（AnnexinV法）线粒体膜势能（mt）的检测DNA片断化检测TUNEL法Caspase-3活性的检测WB检测凋亡相关蛋白的表达和细胞定位分析ApoptosisAssays1.细胞凋亡的形态学检测光学显微镜和倒置显微镜未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色、苏木精染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，呈新月状附在核膜周围。荧光显微镜和共聚焦激光扫描显微镜一般以细胞核染色质的形态学改变来评判细胞凋亡的进展情况。常用的DNA特异性染料有：HO,Hoechst33342;HO,Hoechst33258;DAPI。电子显微镜观察光学显微镜观察NuclearmorphologicalchangesofHeLacellsinapoptosisprocess（488nm400）•电镜观察凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。凋亡Ⅰ期的细胞核内染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象的空泡结构。细胞凋亡的晚期，细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。A、NormalcellB、Apoptosis:Apoptoticbodies2.磷脂酰丝氨酸（PS）外翻分析（AnnexinV法）•磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine,PS）正常位于细胞膜的内侧，在凋亡早期，PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V是一种分子量为3536KD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力特异性结合。将Annexin-V进行荧光素（FITC、R-PE）或biotin标记，以标记了的Annexin-V作为荧光探针，利用流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。磷脂酰丝氨酸外翻分析（AnnexinV法）不同凋亡阶段的区分PI＋Annexin－V细胞凋亡检测DNA含量-PIAnnexin-VAnnexinV-FITCFluorescencePIFluorescenceTimecourseofapoptosisinTF-1cellsculturedinGM-CSF-freemediumApoptoticHeLacellswerestainedwithFITC-AnnexinV+PI3.线粒体膜势能（△）的检测线粒体荧光染料：Rhodamine123、DiOC6（3）、JC-1、TMRM等对线粒体膜电位非常敏感，其荧光的增强或减弱说明线粒体内膜电负性的增高或降低。NIH3T3mousefibroblastsexposuretohydrogenperoxide线粒体膜势能（△）的检测Healthycellapoptoticcells4.DNA片段化分析细胞凋亡时主要生物化学特征是其染色质发生浓缩,染色质DNA在核小体单位之间的连接处断裂,形成180200bp整数倍的寡核苷酸片段,在凝胶电泳上表现为梯形电泳图谱(DNAladder)。5.DNA末端断裂分析6.凋亡的效应分子检测•细胞凋亡的分子机制虽然还不十分清楚，但Caspase即半胱天冬蛋白酶在凋亡过程中是起着必不可少的作用，细胞凋亡的过程实际上是Caspase不可逆有限水解底物的级联放大反应过程。•半胱氨酸蛋白酶，水解底物天冬氨酸C端肽键，因此又称之为Caspases(取英文CysteineC，asparticacid，Asp，proteases的词头)•Caspase家族的结构与分类•ICE亚类Caspase蛋白酶：ICE是单核细胞来源的参与成熟的一种蛋白酶，参与凋亡但不起主要作用；Caspase1，Caspase4，Caspase5，Caspase11Caspase12，Caspase13，Caspase14。•凋亡启动亚类Caspase蛋白酶：Caspase8，Caspase2，Caspase9，Caspase10。•凋亡效应亚类Caspase蛋白酶：Caspase3，Caspase6，Caspase7Caspase家族主要成员序号原名功能底物特异性Caspase-1ICE辅助促炎症WEHDCaspase-2ICE-1凋亡反应DEXDCaspase-3CPP32,Yama,apopain凋亡反应DEXDCaspase-4ICErel-II,TX,ICE-2辅助