五分类血球仪检测原理

MEK7222/8222白细胞分类的测定原理MEK-7222/8222，计数原理是wbc/rbc/plt电阻法，分类是使白细胞通过鞘流进入鞘流池内，然后通过检测对白细胞照射时发生的散射光，对白细胞进行分类。这些散射光，根据血细胞的容积、血细胞的复杂性（有无颗粒、核的构造等）的不同，光的强度和方向有所不同，因此，通过以激光直进方向和同方向小角度的散射光（以下称为Size）、激光直进方向和同方向大角度的散射光（以下成为Complexity）、与激光直进方向相对垂直的方向的散射光（以下称为Granularity）为参数的散点图，可以对淋巴细胞、单核细胞、嗜中性白细胞、嗜酸性白细胞、嗜碱性白细胞进行分类。另外，Size表示血细胞的大小、Complexity表示血细胞的复杂度、Granularity表示血细胞的颗粒的程度。这种方法提供了三个散射图，MAIN散点图NE-EO散点图MO-BA散点图NeutrophilCount(嗜中性白细胞)NECLymphocytoCount（淋巴细胞）LYCMonocytoCount（单核细胞）MOCEosinophilCount（嗜酸性白细胞）EOCBasophilCount（嗜碱性白细胞）BAC散点图有下列三种。纵轴是Size、横轴是Complexity的散点图（以下称为S-C散点图）；纵轴是Size、横轴是Granularity的单核细胞/嗜碱性白细胞分类用散点图（以下称为MO-BA分类用散点图）；纵轴是Size、横轴是Granularity的嗜中性白细胞/嗜酸性白细胞分类用散点图（以下称为NE-EO分类用散点图）。淋巴细胞分布在S-C散点图的LY区域。单核细胞及嗜碱性白细胞分布在S-C散点图的MO-BA区域。进一步展开到MO-BA分类用散点图时，则单核细胞分布在MO区域，嗜碱性白细胞分布在BA区域。嗜中性白细胞及嗜酸性白细胞分布在S-C散点图的NE-EO区域，进一步展开到NE-EO分类用散点图时，嗜中性白细胞分布在NE区域，而嗜酸性白细胞分布在EO区域。通俗的说法是，这个分类原理只有三个角度，国内的介绍材料上说是4角度，这纯属误导，是把激光直射也算上了，在mek的官方材料上根本没有这个说法。在主散射图上就是淋巴lym，单核和嗜碱通道mo+ba,中性和嗜酸通道ne+eo,就是说在小角度光散射确定了体积的情况下结合大角度光散射能够测出的分群只有三个，其中淋巴是确定的。在mo+ba散射图上，清楚的分出了单核和嗜碱，就是说在小角度光散射确定了细胞体积的基础上，结合垂直角度光散射能够区分出两个分群，单核和嗜碱都是确定的，还有一个附属分类就是lic,即巨大不成熟细胞或者被称作为淋巴影子细胞，在这个仪器上并不单独出示lic数据。在ne+eo散射图上，清楚的分出了中性和嗜酸，就是说在小角度光散射确定了细胞体积的基础上，结合垂直角度光散射能够区分出两个分群，中性和嗜酸都是确定的。但是要说明是，我个人认为这五项分类当中有一项是计算出来的，而且，这个仪器在激光部分失灵或者五分类无法工作的情况下，应该可以充当三分类使用，因为wbc有着单独的计数通道，而且也出现wbc直方图，因此，有了直方图通过软件就可以进行分类的，但是官方没有具体的说法。ABXPENTRA计数分类测定方法及原理：1、RBC/PLT:电阻法WBC/BAS计数：电阻法，由于采用差别溶解技术，WBC和BAS被一同计数出来，利用界标线进行判别，提供BAS直方图和WBC,BAS#%数值。上图就是差别溶解之后取得的直方图，WBC总数就是图中WBC和BAS部分的总和，在BAS区域中由于数值很少，因此经常是空白，这时由于针式打印机无法细腻的打印出来的结果，如下图：4、双鞘流（DHSS）分类计数，整个过程如下，血液标本进入LMNE混合池试剂混合形成混合溶液，孵育时间为12秒，这时RBC/PLT/BAS细胞已经被试剂破坏掉，在鞘流泵作用下进鞘流池进行双鞘流计数，首先经过红宝石孔进行电阻法计数，判断细胞体积，然后在200ms之内通过鞘流直径为42um的鞘流通道进行光吸收测定判断细胞内容物，整个计数时间为12秒。这样形成分类散射图，并提供lym,gra,mon,eo,lic,aly的绝对值和百分比。双鞘流计数是abx的专利技术，详细原理如下：根据上图可以看到，在进行双鞘流计数的时候，首先进行的是鞘流电阻计数，对细胞进行体积测定，然后再进行光吸收比率测定，对细胞内容物进行测定，最终将这个细胞在散射涂上标注出来，在双鞘流的上下两端分别加上恒流电源，以保证电阻法测量，孵育后的溶液在右侧鞘流泵的作用下经过6号口进入鞘流池从1号口流出，为了保证这些检测细胞能够正确的通过计数孔和鞘流通道，需要利用外来鞘流来进行矫正，这样，在5，7号口通过左侧鞘流泵注入稀释液来形成第一股鞘流，保护所测混合溶液能够直接通过计数孔并且保证其不发生偏移和扭曲，保证结果准确，混合溶液通过计数孔后，2，4口通过中间鞘流泵注入稀释液形成第二股鞘流，来保证吸光度测量的正常。五、图形及其界标范围的设定：分类图形及界标设定上图是一个标准的分类散射图的样本，清晰的标明了各个细胞形态所处的范围和位置。因此，PENTRA的双鞘流可以理解为电阻法加光吸收度测定，电阻法类似上面所讲的小角度激光测定体积，光吸收度测定就是测定形态，根据细胞染色原理，不同的白细胞染色后，细胞质和细胞核所形成的颜色不同，那么测定其通过去的光的波长可以知道其本身的颜色，因此这种方法一经问世，立即引起全世界范围的关注，特别是库尔特，库尔特认为这种方法如此简单成本和实现起来均好于库尔特本身的VCS技术，因此洽谈购买，但是ABX宁可自己实现起来结构不尽合理也不愿意出卖，因此就有了双方妥协的产物BACKMAN-COULTERACT5DIFF这个OEMABX的五分类产品。在这一个电阻体积，一个吸光度测定的实现中，成功的分出了4项分群，LMNE既淋巴、单核、中性和嗜酸，并且还有两个附属分群，LIC和ALY既巨大不成熟细胞和异常淋巴细胞，在仪器状态良好和试剂过关的情况下，这6项分群及提示可靠性极高；由于细胞染色后单核和嗜碱很难被区分，所以，就有了前面的差别溶解技术的WBC总数和BASO的电阻法分群，因此以前的PENTRA宣传材料上有7分类之说，后来有些不严谨和炒作之嫌，改回现在的5+2分群宣传。顺便提一下，仅WBC分类图形是由一个散射图和一个直方图来实现的，如果加上RET的话，会增加三个散射图并增加一个水平90度的光散接受，这是单独给RET的。SYSMEX的计数分类原理以XT1800/2000为例RBC/PLT计数采用电阻法。LMNE和WBC/BASO均采用激光鞘流测定方式，下面解释这种方式，上图是测试原理图示，官方的解释如下：在小角度散射光测定中，可以得到细胞的体积（外径），作为散射光，并非从一点开始，而是细胞的全体，一定角度的散射光会重合，而另一部分没有重合的相对信号较弱，因此重合的散射光可以得到很强的信噪比，从而得到细胞体积的信息，经过反复试验，入射角度在1-6度为最佳，因为小细胞遇到的光散射小，大细胞散射光多，因此来区分的。在大角度散射光测定中，光线照射在细胞核上发生散射，在一定角度下可以测的细胞核的信息，因此选定8-20度最佳角度可以得到细胞核信号的最佳信噪比，淋巴单核的细胞核较小，因此得到较少的散射光，中性粒细胞的细胞核比较大也比较多，因此得到的光散射也较多，因此来区分。以上是小角度散射光的图示以上是大角度光散射的图示在xt1800/2000的机器中，不算RET可以得到2个散射图，并同时得到5项分群的全部参数。在DIFF散射图当中可以得到LMNE四个分群，在WBC/BASO的散射图当中可以得到BASO的分群。上图就是SYSMEX的WBC分群散射图COULTER五分类测试原理和分类实现COULTER的RBC/PLT/WBC总数依然采用电阻法WBC分类方面采用VCS技术Coulter公司设计在单一通道上同时用这三种方法对同一白细胞进行测量，避免了有些血液分析仪要设计好几个通道或加染色试剂的麻烦。很显然，有些细胞，如嗜中性与嗜酸性细胞，若单用一两种方法（如体积加散射）结果十分相似，其二维散点图上有相当大的重叠。用了VCS技术后，一般在三个方面完全一致的情况是很少见的。加上仪器配备了先进软件，可以像流式细胞仪一样调校、设置门限，可在三维图像上将各细胞较好的分开，达到较准确的分类。减少flag的假阳性和假阴性，减少复检率，并可提示幼稚白细胞、异型淋巴细胞等。VCS技术在Coulter公司的STKS、MAXM以及Gen.s上均已成功的应用。。此外这类仪器还可直接计数CD4和CD8淋巴细胞，并算出其比率。其原理是：将包被了抗CD4和CD8单克隆抗体的聚苯乙烯微球，加到血中。含有相应表面标志（抗原）的淋巴细胞会结合相应的微球，从而改变了该细胞的VCS性质，即可在STKS等型号后的分析仪上加以测定。官方资料如下：库尔特运用VCS技术对白细胞进行五项分类，运用V、C、S三种探针，在流式通道的检测点，对通过的单列白细胞进行逐个的、同时的、三重的检测，用三维分析技术直接分类白细胞各亚群。库尔特白细胞分类用试剂先溶解红细胞，再使白细胞恢复到原态，进入流式通道接受检测。在流式通道内运用鞘流技术，令其在流式通道内作最适的单细胞排列，逐个、同时地接受VCS三重检测。上图是体积测定VCS技术运用V、C、S三种探针，从体积、细胞核特性、颗粒特性等方面综合分析白细胞，检测细胞的视角与手工镜检相似。1．用低频电流准确分析细胞体积，是库尔特专利技术。体积是区分白细胞亚群一个很重要的参数，它能有效区分淋巴细胞和单核细胞。上图是高频传导2．Conductivity-Opacity(传导性-阻光性)运用高频电磁探针检测细胞核及核质比的特性，是库尔特专利技术。细胞膜对高频电流具传导性，当电流通过细胞时，细胞核的化学组份令电流的传导产生变化，其变化量(RF)可以用来反映细胞内含物的信息。该参数可用来进一步区别体积差不多的细胞，如：淋巴细胞和嗜碱细胞，由于它们的细胞核特性不同而在传导性参数上有所区别。上图是光散射3.LightScatter-RLS(激光散射)运用一个氦氖激光源发出的单色激光扫描细胞，收集细胞在10O～70O的散射光(MALS)，提供关于细胞颗粒性的信息。可以很好地区分颗粒特性不同的细胞。上图是VCS整体技术示意图4.三维分析仪器将检测8,192个白细胞，根据每个细胞的V、C、S检测量，将它们分布到一个VCS三维坐标(分辨率为256×256×256=16,777,216)上，得到白细胞各亚群的分布区，其分辨率是至今为止最高的。高分辨率不仅令五项分类清晰，还可以提示许多异常细胞区域的报警。DIFF分类图1DIFF分类图2DIFF分类图3，立体3D图形分析在三个散射图当中可以清晰的分出5个分群，在STKS和HMX等机型上除了有RET散射图之外，由于增加的T淋巴亚群的标志物，因此可以对某些T淋巴亚群进行分群，从而多出2个或以上的流式离散图。上图是VCS检测部分示意图ABBOTTWBC分类技术的实现ABBOTT的五分类型号众多，从3000开始，3500，3700，3200，到现在的4000，除3200外，其余都采用RBC/PLT电阻法，WBC总数是两种计数方法比对，即电阻法和激光法（多角度偏振激光散射测定，MAPSS）用两种方法分别进行WBC总数测定，从而准确性极高，3200只用MAPSS一种方法进行WBC/PLT/RBC的总数及WBC分类测定，下面讲述分类的实现：多角度偏振光散射白细胞分类技术（multi—Anglepolatisedscatterseparationofwhitecell,MAPSS）其原理是一定体积的全血标本用鞘流液按适当比例稀释。其白细胞内部结构近似于自然状态，因嗜碱性粒细胞嘌粒具有吸湿的特性，所以嗜碱性粒细胞的结构有轻微改变。红细胞内部的渗透透压高于鞘液渗透压而发生改变，红细胞内的血红蛋白从细胞内游离出来，而鞘液内的水分进入红细胞中，细胞膜的结构仍然完整，但此时