细胞迁移和侵袭实验

1-4细胞迁移和侵袭实验实验准备：细胞，24孔板，transwell小室（8µm，24孔板专用），ECMGel，10%FBS+培养基，无血清培养基，10µ、200µL、1000µL移液器及配套枪头，1.5mLEP管，冰盒实验设计：实验分组一般分为阴性组（上下层均没有趋化因素），实验组（按照实验需要，上层或者下层加入趋化因素），对照组（趋化因素与实验组中的相反）。如果有特别需要，可以再加上阳性组（上下层都有趋化因素）。实验操作（请细读注意事项）：一、细胞侵袭实验1.ECMGel原液提前1h放在4℃冰箱中解冻，实验前转移到冰盒中。2.将1.5mLEP、枪头盒、transwell放在24孔板里面后，置于冰上预冷。3.根据自己的使用量，按照ECMGel:无血清培养基=1:7.5在冰上稀释成使用液。4.把枪头剪去一小段（约3µm）后在冰上吸取40µL/孔ECMGel使用液轻轻加入transwell上室中，加入时慢慢移动枪头，保证液体平铺在底部。5.放在37℃孵箱15min，让胶凝固。6.消化、离心、计数细胞后，按照2.5x104/mL用无血清培养基稀释细胞，制成细胞悬液（如果细胞很多，这一步可以提前，在4、5之前做）。7.按照每孔200µL，将细胞悬液加入transwell上室，同时在transwell下室加入10%FBS+培养基500µL，放入37℃孵箱培养。8.若干小时后取出，吸去transwell上室多余液体，用PBS清洗两次，用棉棒在上室中轻轻转动，吸干水分并擦去膜内侧的细胞。9.在上室中加入结晶紫染液，染色5min，回收染液，用流水缓缓冲去染液，再次用棉棒在上室中轻轻转动，吸干水分。10.在正置显微镜上放置一块载玻片，将transwell小孔倒置放在上面，拍照。11.在100倍视野下，对膜的上下左右及中间计数，做平均数。2-412.清洗transwell，可以反复使用。二、细胞侵袭实验细胞迁移实验不需要ECMGel包被，其余步骤一致。实验原理：多孔膜是聚碳酸酯膜（polycarbonatemembrane），膜带有微孔，孔径大小有0.1－12.0µm。将Transwell小室放入对应的培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。细胞迁移和侵袭实验常用8.0µm膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细胞会向营养成分高的下室运动，从而从多孔膜一侧穿过，贴壁于多孔膜的另一侧，计数其细胞量可反映肿瘤细胞的迁移或者侵袭能力（圆形透明小孔为微孔）。（注：迁移和侵袭是两个概念，迁移是指细胞的运动能力，而侵袭是细胞在运动的同时会分泌出消化ECM的蛋白，清除运动障碍，这个实验更能模拟人体内环境）注意事项1.ECMGel（货号：E1270）由Sigma公司生产，来源于大鼠肉瘤的细胞外基质提取物，保存在-20℃，由于在室温中会快速凝固，不可逆，因此需要在冰上溶解和操作，同时一切要与ECMGel接触的耗材也需要预冷，避免俩3-4者接触时温差较大引起ECMGel凝固粘附，造成浪费。2.本组常用的Transwell是Millipore公司生产的8um悬挂式millicell（货号：MilliporePIEP12R48MillicellHangingCellCulture24wellPET8um）。每次使用完后用0.25%胰酶浸泡膜底10min去除贴底细胞，清洗，棉签温柔擦拭，75%乙醇浸泡24h，晾干，使膜上粘附的细胞和染液完全洗脱，下次使用前紫外照射正反两面，各30min，通常可以反复用3-5次3.制作ECMGel使用液时，先加入培养基，再加入ECMGel；同时在使用量的基础上多配置5-20uL（使用量多就多配点），避免液体挂壁造成最后一次加样不够。4.加胶时，胶的量以刚好把胶浸湿为最好（24孔的millicell需要35-40uL），过厚细胞侵袭变慢，过少则失去侵袭实验的意义；完成后可轻轻地，均匀地拍打培养板四个侧面，让液体完全平铺，这样可以避免因为胶的厚薄不均而引起的误差。5.凝固时间可以适当延长，但最好不要超过30min，防止液体挥发使gel凝固得过硬。6.通常先根据细胞的侵袭能力估计每孔小室加入的细胞数量，侵袭能力强的细胞（如231，CAF）每孔加入5,000个，那最后的细胞悬液应该制备成2.5x104/mL，而侵袭能力弱的细胞（如MCF-7）可以提高细胞数量，达到10,000个，那最后的细胞悬液应该制备成5x104/mL。上层加入细胞悬液后可轻轻地，均匀地拍打培养板四个侧面，让液体完全平铺，避免细胞分布不均而引起细胞计数时中间多两边少。7.加入下室中的10%FBS是作为趋化因子诱导细胞运动，24孔板下室一般加入500µl含FBS的培养基，不同的培养板加的量有不同要求，具体请参考说明书。这里要特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，气泡处的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，小室在放入时倾斜缓慢放入（注意小室中的液体不要流出），可以4-4避免气泡。培养时间需要自己根据文献做预实验，寻找合适的时间点；时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，细胞数及处理因素对细胞数目的影响也不可忽视，穿过的细胞数在100-200之间最好。棉签清洗时一定要轻柔，防止戳破多孔膜。8.结晶紫是细胞核染液，细胞大小不同，染色时间也有改变，染液放置的时间和浓度也会对染色时间有影响，需要自己掌握；最优的染色状态是细胞核颜色深，胞浆色浅。