免疫荧光技术课件概要

免疫荧光技术Coons和Coworkers（1941）通过荧光素标记抗体，并借助荧光显微镜观察荧光的发光物质，而建立了该项技术，人们在Coons等的基础上发展完善了这一技术。尤其是近年来，与激光技术、电子计算机、扫描电镜和双光子显微镜等技术结合发展为定量免疫荧光技术；荧光激活细胞分类器（FACS）的应用，激光共聚焦显微镜的问世，使这门技术发展到更高的阶段，开创了免疫荧光技术的新领域。第一节免疫荧光技术的原理一、免疫荧光技术的基本原理免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）。在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光（黄绿色或橘红色），可以看见荧光所在的组织细胞，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。这两种方法总称免疫荧光技术，以荧光抗体方法较常用。用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞（或组织）化学技术。免疫荧光细胞化学分直接法、间接法和补体法以及与亲和化学物质标记荧光素的方法，例如：SPA荧光素标记物，生物素与卵白素、植物血凝素荧光素标记物等。二、荧光产生的原理分子都含有电子，电子在不断地运动着。根据量子理论，运动着的电子可以处于一系列不连续的能量状态（即能级）中，电子遵守一定的规则，可以从一个能级向另一个能级跃迁，并伴随着与能级差相对应的特定能量的吸收或释放。一般情况下，电子总是处于能量最低的能级（即基态）。在一定的条件下，电子可吸收能量（如光能，热能，电能，机械能等）跃迁到较高能量级（即激发态），这个过程叫激发。处于激发态的电子是不稳定的，它总是要跃迁回到基态，并将多余的能量释放出来。跃迁方式可能是辐射跃迁，也可能是非辐射跃迁。以非辐射跃迁时，能量大多转化为热能，而以辐射方式跃迁时，能量转化成相应波长的光，这个过程叫发射。跃迁到激发态的电子，大多处于单重激发态。如果电子直接从单重激发态以辐射方式跃迁到基态，由于单重激发态很不稳定，半衰期很短，发射持续的时间也很短，这种发射光叫荧光，其寿命较短。1838年Brewster首先描述了荧光现象，但荧光一词，是由Stokesl852年提出的。第二节荧光素一、荧光色素能够产生荧光并能作为染料的化合物称为荧光色素，荧光色素必须具备吸收激发光的光能并发射荧光，具有吸收一定频率光能的生色团和能产生一定光亮子的荧光团。吸收的光能转变为荧光的百分数称为“荧光效率”。荧光效率与发射荧光量子的数值成正比。荧光效率（%）=（发射荧光的光量子数）×100（吸收光的光量子数）荧光强度（即发射荧光的光量子数）和激发光（吸收的光量子数）的强度有关，激发光越强，荧光也越强。荧光素可以发射红、橙红、黄、绿及蓝色等荧光。光的强弱也与溶解荧光素的pH值、浓度、染色时间和温度等条件有关。荧光素的种类很多，但用于标记抗体的荧光素，不同于一般荧光色素，它必须具备以下条件：①应具有与蛋白质分子形成共价键的化学基因，结合后不易理解，而未结合的色素及其降解产物容易排除。②荧光效率高，与蛋白质结合荧光效率下降不多。③结合抗体蛋白后对抗体的免疫学性质和生化性质无影响，用于活体内标记，结合应无毒性，附加抗原性小。④与蛋白质结合的方法简便而快速，结合物在一般条件下稳定。⑤荧光素容易溶解，溶解后不会和其他物质发生化学反应。⑥荧光颜色与背景组织的自发荧光颜色对比鲜明，能清晰判断结果。二、可用于标记抗体的荧光素用于标记抗体和蛋白质的荧光色素到目前为止有以下几种。1.异硫氰酸荧光黄（fluorescienisothiocyanate，FITC）纯品为黄色粉末，有两种异构体，易溶于水和乙醇等溶剂，在溶解状态下呈黄绿色荧光。性质稳定，低温干燥下可保存多年，室温下也可保存两年以上。FITC分子质量为390u，最大吸收光谱为490～495nm，最大发射光谱为520～530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。其中异构体I型荧光效率更高，与蛋白质结合更稳定。其结构式，在碱性条件下，FITC的异硫氰酸基在水溶液中与免疫球蛋白的自由氨基经碳酰胺化而形成硫碳氨基键，结合成为标记荧光免疫球蛋白，即荧光抗体。1个IgG分子上最多能标记15~20个FITC分子。2.四甲基异硫氰酸罗达明(tetramethylrhodamineisothcyanate，TRITC)是一种紫红色粉末，较稳定，是罗达明(Rhodamine)的衍生物，易溶于水。最大吸收光谱为550nm，最大发射光谱为620nm，呈橙红色荧光，与FITC发射的黄绿色荧光对比鲜明。经常用于双标记染色，使用较多。3.四乙基罗达明（tetraethylrhodamineB200，RB200)RB200是褐红色粉末状，溶于乙醇和丙酮，不溶于水。最大吸收光谱为570nm，最大发射光谱为596～600nm，呈橙红色荧光。因为RB200比较低廉，广泛用于染色和双标记示踪或染色。RB200不能直接和蛋白质结合，要先经五氯化磷（PCI5）作用下转变成黄酰氯（S02C1），在碱性条件下易与赖氨酸s氨基反应而结合在蛋白分子上。其分子质量为580u。4.其他荧光素如4-乙酰胺-4-异硫氰酸-2-硫酸（SITS）呈蓝色荧光；得克萨斯红（Texasred）、藻红素R（phycoerythrin-R）、花青（cyanine，Cy2，Cy3，Cy5）等。第三节荧光素标记抗体的方法一、标记方法：采用FITC标记抗体的方法常用Marsshall（1958）法标记荧光抗体，也可以根据条件用Chadwick等（1960）标记法或Clark等（1963）的透析标记法。1、Marsshall法：（1）材料：抗体球蛋白溶液、0.5mol／LpH9.0的碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素、1％硫柳汞水溶液、三角烧瓶（25～50m1）、冰及冰槽（或1000ml烧杯）、电磁搅拌器、灭菌吸管、透析袋、玻棒、棉线及烧杯（500m1）、pH7.2或8.0的0.01mol／LPBS等。②荧光素的准备：根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克蛋白加0.01mg荧光色素，用天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末。③结合（或标记）：边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入球蛋白溶液中，避免将荧光素粘于三角烧瓶或搅拌玻棒上（大约在5~10min内加完），加完后，继续搅拌12h左右。结合期间应保持蛋白溶液与4℃左右。结合完毕后，将标记的球蛋白溶液离心（2500r／min）20min，除去其中少量的沉淀物。④透析：装入透析袋中再置于烧杯中用pH8.0的缓冲盐水透析（0~4℃）过夜。⑤过柱：取透析过夜的标记物，通过葡聚糖凝胶G-25（SephadexG-25）或G-50柱，分离游离荧光素，收集标记的荧光抗体进行鉴定。洗脱液：0.01mol／L磷酸盐缓冲液（pH7.2）；过滤量：12ml标记全球蛋白液（过滤前未透析）；收集量：20ml（解析1.7倍）。分别以1mgFITC溶于2份lml0.5mol／L。碳酸盐缓冲液（分别为pH9.5和pH9.0），于2℃下搅拌将其各加入100mg家兔IgG生理盐水溶液中，搅匀后立即将每份分为两半。一半保留于2℃下，另一半置25℃下。间隔一定时间后各取出0.5ml通过SephadexG-25去游离FITC，由此计算出5mg家兔IgG结合的FITC量。2、改良法（1）试剂配制：①0.01mol／LpH7.2的PBS配法：NaCl18g、Na2HPO41.15g、KH2PO4+0.2g溶于2000ml蒸馏水中，校定pH值至9.0。②0.5mol／LpH9.0碳酸盐缓冲液配法：取0.5mol／LNa2CO3（5.3％）10ml加入0.5mol／LNaHCO3（4.2％）90ml，混合后，校定pH值至9.0。③3％重碳酸钠水溶液配法：称1.5g无水碳酸钠充分溶解于50ml灭菌蒸馏水即成。（1）试剂配制：①0.01mol／LpH7.2的PBS配法：NaCl18g、Na2HPO41.15g、KH2PO4+0.2g溶于2000ml蒸馏水中，校定pH值至9.0。②0.5mol／LpH9.0碳酸盐缓冲液配法：取0.5mol／LNa2CO3（5.3％）10ml加入0.5mol／LNaHCO3（4.2％）90ml，混合后，校定pH值至9.0。③3％重碳酸钠水溶液配法：称1.5g无水碳酸钠充分溶解于50ml灭菌蒸馏水即成。藻红蛋白及标记方法藻红蛋白或称藻胆色素蛋白，他存在被称为藻红的多聚微粒中，位于叶绿素的反应中心，在自然结构中，藻红蛋白吸收光能，吸收后转化成能量，供其发育、生长。当藻红蛋白被分离和纯化后，其蛋白质变得具有很强的荧光，能吸收不同波长的光，发出亮红色的荧光，此时不再接受任何外来的光，也不能转移光能。藻红蛋白利用共价键结合的形式与免疫球蛋白结合，形成稳定的复合物。应用其复合物进行免疫荧光组化染色，进行定量和定性分析；也可以应用藻红蛋白抗体结合物进行免疫荧光的双重或多重染色。尤其是藻红蛋白的亚型可以发射不同波长的荧光，例如PE的发射波长为520~570nm，吸收光谱为490～510nm，正好与FITC处于同一的吸收和发射波长上，利用这一特点进行双重标记，在荧光显微镜下，可同时观察到代表2种抗原成分的不同颜色（亮绿色和橘红色），大大简化了免疫荧光的双标。当然还可以和其他荧光素，胶体金结合进行免疫荧光或流式仪的三重以上标记。标记方法如下：1.巯基化藻红蛋白（phycoerthrin，PE）的制备600μ1的15.5mg／m1盐酸巯醇亚胺（iminothiolanehydrochloride）加到1.2ml的3.6mg／m1的PE中，和1.2mlPB（pH6.8）混合，装入透析袋置人50mmol／LpH6.8PB中透析，4℃过夜，再换用pH7.5PB透析6h。每个PE分子中可结合8个巯基。2.PE-IgG制备异双功能试剂SPDP—[N-succinimdyl3-（2-pyridyldlthio）propi-nate]30μg（1.1mg／m1）的乙醇溶液，加入700ml的4.2mg／mllgGPB溶液（50mol／LpH7.5），在室温中反应2.5h。再加入巯基化PE400ml（1.7mg／m1）加到500μl反应混合液中，室温反应12h，加入100ml的50mmol／L碘乙酸封闭残余巯基，用PB透析4℃过夜。加入0.01％NaN3分装，4℃保存半年。3.PE-标记蛋白A方法①取4.08mgPE溶于0.1mol／LpH7.4PB(含0.1mol／LNacl)lml中，溶解后，取出0.5ml，再加入10mlSPDP无水甲醇液(2.6mg／ml)，SPDP／蛋白摩尔值为10，22℃反应5min，过SephadexG—50(1×17cm)，用100mmol／LpH7.4PBS(含0.1mol／LNaCl)平衡和洗脱。②0.5ml蛋白(2mg／m1)100mmol／LPBS(含有100mmol／LNaClpH7.4)，加入2.6mlSPDP甲醇液，SPDP／蛋白＝9.5，22℃40min，加入25mmol／L二硫苏糖醇(DTT)pH7.4缓冲液，22℃25min，同上过sephadexG—25，收集蛋白A峰。③取0.77mg／m1的PE和0.27mg／ml蛋白A等量混合，22℃反应6h，混合物4℃保存备用，以上两种PE标记制品，可最后溶于0.01mol／LpH7.4PB(含有0.1mol／LECTA、lmol／L碘乙胺、1％BAS和0.1％NaN3)，0—5℃保存。荧光素的种类不同，标记方法也有所不同，但所有要求的条件和步骤大致相同.影响标记的因素有温度、pH及反应液中荧光素和免疫球蛋白的比例。温度低标记时间长，温度高标记时间短。在