细胞凋亡的几种检测方法

细胞凋亡的几种检测方法1、形态学观察方法（1）HE（苏木精—伊红染色法）染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。（2）丫啶橙（AO)染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。（3）台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。（4）透射电镜观察：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。2、DNA凝胶电泳细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片断增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180－200bpDNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。正常活细胞DNA电泳出现阶梯状（LADDER)条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带3、酶联免疫吸附法（ELISA)核小体测定凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA法检测。检测步骤1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体；2、在微定量板上吸附组蛋白体’3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合‘4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合’4、加酶的底物，测光吸收制。用途该法敏感性高，可检测5*100/ml个凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。该法不需要特殊仪器，适合基层工作，但是不能精确测定凋亡细胞发生的绝多对量。3、流式细胞仪定量分析细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间。利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞核凋亡细胞。应用价值流式细胞仪检测具有以下特点：1)、检测的细胞数量大，因此其反映群体细胞的凋亡状态比较准确2)、可以做许多相关性分析3)、结合被检测细胞的DNA含量的分析，可确定凋亡的细胞所处的细胞周期（1）检测形态学及细胞膜完整性的Hoechs-PI双染色法细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性液增加，但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间，利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪检测细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。利用Hoechs-PI染色法，正常细胞对染料有抗拒性，荧光染色很浅，凋亡细胞主要摄取Hoecha染料，呈现强蓝色荧光，而坏死细胞主要摄取碘化丙啶（PI)而呈强的红色荧光。（2）DNA片断原位标记法凋亡细胞DNA片断原位末端检测技术是指在细胞（或组织）结构保持不变的情况下，用荧光素、地高辛或生物素标记的脱氧尿三磷酸（DUTP)和末端脱氧核苷酸转移酶（TdT)相反应与凋亡细胞裂解后3•的羟基（－OH）端结合，经显色反应后检测DNA裂解点的技术。DNA片段原位标记法有二种：1、原位缺口转移（insitunick-translation,ISNT)技术，它是利用DNA多聚酶I将标记的核苷酸连接到断裂DNA的3•－OH端2、原位缺口末端标记技术（insituendlabellingtechnique,ISEL)，即TUNEL法，它是利用TdT将标记的DUPT接到3•-OH端。研究证明，TUNEL法的敏感性远高于ISNT，尤其对早期凋亡的检测，TUNEL更为合适。（3）检测细胞膜成分变化的AnnexinV联合PI法原理：在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰丝氨酸（PS)迁移至细胞膜外测。磷脂结合蛋白V（AnnexinV）是一种钙依赖性的磷脂结合蛋白，它于PS具有高度的结合力。因此，AnnexinV可以作为探针检测暴露在细胞外测的磷脂酰丝氨酸。故利用对PS有高度亲和力的AnnexinV，将AnnexinV标记上荧光素（如异硫氰酸荧光素FITC），同时结合使用PI拒染法（因坏死细胞PS亦暴露于细胞膜外测，且对PI高染）进行凋亡细胞双染法后用流式细胞仪即可检测凋亡细胞。结果判断：正常活细胞AnnexinV、PI均低染；凋亡细胞AnnexinV高染、PI低染；坏死细胞AnnexinV/PI均高染。应用价值：细胞发生凋亡时，膜上的PS外露早于DNA断裂发生，因此AnnexinV联合PI染色法检测早期细胞凋亡较TUNEL法更为灵敏。又AnnexinV联合PI染色不需固定细胞，可避免PI染色因固定造成的细胞碎片过多及TUNEL法因固定出现的DNA片段丢失。因此，AnnexinV联合PI法更加省时，结果更为可靠，是目前最为理想的检测细胞凋亡的方法。方法及步骤A.直接标记抗体（FITC标记抗体）：(1)收集1×106个细胞，800rpm离心5min，4℃以上冷PBS洗一次。(2)用4%多聚甲醛1ml室温固定40分钟，800rpm离心5min去上清。加2mlPBS重悬洗涤细胞，800rpm离心5min。(3)用1ml含5%人血清的PBS重悬细胞，冰上孵育10min，800rpm离心5min去上清。加入200ul含0.5%BSA和饱和剂量的荧光标记抗体(5×105个细胞/20ul抗体)的PBS,避光冰上放置30min,离心弃上清。加入200ul1%多聚甲醛固定，待测即可。(4)用流式细胞仪检测荧光值,每管计数10000个细胞。B.未标记抗体间接免疫荧光标记法：（1）收集2×106个细胞，用冷的PBS2ml洗涤细胞一次，800rpm离心5min。（2）用2ml4%多聚甲醛室温固定细胞40min,800rpm离心5min；2mlPBS重悬细胞，800rpm离心5min；（3）用1ml含0.2%Triton-X100和5%血清的PBS重悬细胞，冰上放置10min,800rpm离心5min。（4）加入饱和剂量未标记抗体，冰上放置40min,800rpm离心5min，用2ml冷的PBS重悬细胞，800rpm离心5min，洗去未结合一抗，重复一次。（5）加入荧光标记（FITC）标记的二抗，冰上避光放置40min后，800rpm离心5min，去上清，PBS洗涤两次。（6）加入0.5ml1%多聚甲醛重悬细胞；固定待测。（7）流式细胞仪检测荧光值,每管计数10000个细胞。C.细胞周期、细胞凋亡及DNA倍体分析样品（PI染色）的制备：（1）待测样本制成单细胞悬液，然后200g离心5分钟，弃上清。（2）用4℃预冷的70%冷乙醇固定，4℃保存，至少固定18小时。（3）调整细胞浓度为106细胞/毫升，取1毫升细胞悬液，用PBS洗三次，细胞重悬于1毫升PI染液中，37℃孵育30分钟即可进行流式分析。（4）PI染液终浓度为50微克/毫升，RNaseA终浓度为20微克/毫升。培养细胞染色体显示法（1）传代培养细胞染色体显示法培养细胞—加秋水仙素—采集分裂细胞—离心—低渗处理—预固定—固定—重复固定—制片—染色和封片1．培养细胞：取处于指数生长期、用较大瓶皿培养的、80％～90％汇合单层培养细胞。
2．加秋水仙素：使用最终浓度为0.02～0.8微克/毫升营养液，温箱继续培养6～10小时；或用低温封闭法：把培养细胞置于4℃条件下6～12小时后，再于37℃温箱继续培养6～10小时处理（加秋水仙素）。
3．采集分裂细胞：可利用分裂中期细胞体变圆与底物附着不牢特点，此时手持培养瓶，左右反复横向水平摇动，令培养液在培养细胞表面反复冲刷。应用此法可使90％的中期分裂细胞从瓶壁脱落，注意勿用力过猛，以防多量非分裂细胞脱落影响观察。
4．离心：收集培养液，1000转/分钟离心5～10分钟。
5．低渗处理：吸除上清液、加入预温至37℃的0.075MKCl溶液，在温箱中静置20～30分钟。
6．预固定：向悬液中加新鲜1：3醋酸、甲醇固定液1ml，用吸管吹打调匀，此措施能起到先使细胞表面轻微固定，可防止固定后细胞粘连成块。
7．固定：离心，同4，吸除上清液，加新鲜固定剂5～10ml；加固定剂时要用一手微斜持离心管，另手用吸管吸取固定剂，把固定剂逐滴滴在离心管壁上，使之慢慢流入离心管中，然后轻轻吹打均匀，置15～20分钟。
8．重复7，末次离心后，小心吸除大部分上清，据悬液中细胞密度大小，余下固定液0.5～1ml。
9．制片：用滴片法制片，按如下步骤：彻底洗净载物片，勿留任何油脂，置冰箱中储备备用。滴片前现从冰箱中取出冷载物片1片，在载物片表面出现细微水气时，立即向片的一侧滴2～3滴细胞悬液，滴片时的距离能保持半米高度才好。滴片后置室温中令其自然干燥，或用吹风机热风吹干亦可。如此制备好的标本可置盒中备用或立即进行染色观察。
10．染色和封片：一般常用Giemsa染色：取干液Giemsa1份加pH6.8磷酸缓冲液9份混合，染色10分钟后，水洗、晾干、可直接观察。如标本需要保存或做长时间观察，可过二甲苯两次后，用中性树胶封片后，再过二甲苯，然后封片亦可。
（2）人末梢血微量全血培养染色体显示法
1．培养液准备：取15ml培养瓶数个，每瓶内分别充入5ml培养液（pH7.2），内含：1640培养液（含10％～15％小牛血清），PHA0.1ml，青霉素100单位和链霉素100微克/毫升培养液
2．抽血针管准备：取2～5ml针管一支，在消毒后的无菌操作台或无菌操作箱中安装好注射器，无菌抽肝素（100U/mlBBS）少许湿润针管，如动作迅速不用肝素亦可。
3．采血：用棉签75％酒精给患者或献血者的皮肤消毒两次，缚止血带，静脉取血1～2ml。无菌操作迅速向每一瓶培养中加血0.4～0.5ml，如系外出采血，安装针管及分装血液两步骤亦可在无菌条件略差的环境内操作，但动作要迅速，以减少污染；在采血量不多或不应抽血的情况下，亦可在耳垂、手指肚（无名指）用刺血针采血。
4．培养和加秋水仙素：37℃温箱中培养到60～72小时之间，此时细胞分裂相最多，向每培养瓶内加秋水仙素，最终浓度0.02～0.08微克/毫升营养液，再培养4～6小时。
5．低渗：1000转/分钟离心10分钟，吸除上清液，加入预温过的0.075MKCl溶液10ml，置温箱中低渗处理15～20分钟。
6．其余步骤与处理传代细胞法相同。
（3）羊水细胞培养
1.抽取羊水：无菌抽取羊水10-20ml，立即注入无菌离心管
2.离心分离：1000转/分离心10分钟，弃去上清，留0.5ml.
3.培养：加培养液4ml（含小牛血清1ml），用NaHCO3调PH至6.8，置37度培养，在温箱培养7-10天，可见大量成纤维细胞或上皮样细胞生长；加秋水仙素0.02-0.8微克每毫升营养液，作用10-12小时。
4.其余步骤与传代细胞染色体制备方法相同。
一般染色体制片程序
1、取对数生长期细胞一个T75或T25瓶。
2、将培养基换成10mlDMEM(H)+10%FBS+0.1ug/ml秋水仙素的培养基，处理1~2小时。
3、将细胞培养液倒掉，马上加入3~4ml0.1%胰蛋白酶，并立即摇晃0.5~1min。当在显微镜下看到分裂相细胞脱壁后，马上加入终止液终止消化，并将分裂相细胞收集在一个15ml的离心管中，并在1200r/min离心4min。
4、将上清液倒掉，剩余50ul左右的液在管中，并轻微震动，使细胞沉淀重新悬浮。
5、加入10ml的低渗液（0.075MKCL），第一毫升要逐滴加入，并边加边摇晃。
6、37℃水浴中低渗30min。
7、再加入1ml冰冷的固定液（甲醇：乙酸=3：1的混合液），并马上摇匀，离心，1000r/min、10min。
8、同步骤4。
9、加入10ml冰冷的固定液，第一毫升要逐滴加入，边加边摇晃。
10、室温下固定30min，然后离心，1000r/min、10min。
11、同步骤4。
12、加入10ml冰