发酵工程期末考试重点整理

●发酵工程：以微生物、动植物细胞为生物作用剂进行工业化生产的工程，包括发酵工艺和发酵设备。●主要研究内容：菌种选育与构建、大规模培养基和空气的灭菌、大规模细胞培养过程、细胞生长和产物形成动力学、生物反应器的优化设计和操作、发酵产品的分离纯化过程中的技术问题等。●发酵工程原理：指导发酵产品研究与开发，发酵工厂设计与建设以及发酵生产实践的理论。●初级代谢：是许多生物都具有的生物化学反应，蛋白质、核酸的合成等，均称为初级代谢。●初级代谢产物：指微生物通过代谢活动所产生的、自身生长和繁殖所必需的物质，如氨基酸、多糖等。●次级代谢：微生物以初级代谢产物为前提合成的对微生物本身的生命活动没有明确功能的物质的过程。●自然选育：不经过人工处理，利用菌种的自然突变而进行菌种筛选的过程。●杂交育种：将两个基因型不同的菌株经吻合使遗传物质重新组合，分离和筛选具有新性状的菌株。●诱变育种：利用物理、化学等诱变剂处理均匀而分散的微生物细胞群，在促进其突变率显着提高的基础上，采用简便、高效的筛选方法，从中挑选出少数符合目的的突变株，以供科学实验或生产实践使用。●原生质体融合育种：两个亲本的原生质体在高渗条件下混合，由聚乙二醇作为助融剂，使它们互相凝集，发生细胞融合，接着两个亲本基因组由接触到交换，从而实现遗传重组。●前体：某些化合物加入发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中结合到产物中去，而自身结构并没有明显变化，产物的产量却因前体的加入而有较大的提高。●抑制剂：某些化合物可以抑制特定代谢途径的进行，使另一种代谢途径活跃，获得人们所需产物的积累。如生产甘油加抑制剂亚硫酸钠，它与代谢过程中的乙醛生成加成物。这样使乙醇代谢途径中的乙醛不能成为NADH2(还原型辅酶I)的受氢体，而使NADH2在细胞中积累，从而激活α－磷酸甘油脱氢酶的活性，使磷酸二羟基丙酮取代乙醛作为NADH2的受氢体而还原为α－磷酸甘油，其水解后即形成甘油。●促进剂：指那些既不是营养物质又不是前体，但却能提高产量的添加剂，如加巴比妥盐能使利福霉素单位增加，并能使链霉菌推迟自溶，延长分泌期。●灭菌：用化学或物理的方法杀灭或除掉物料及其器皿中所有的生命体。消毒是指杀死病原微生物的过程。●分批灭菌：培养基置于发酵罐中加热，达到预定温度后维持一段时间，再冷却到发酵所需温度的灭菌。●连续灭菌：在发酵罐外连续不断地进行加热、维持和冷却，同时把灭完菌的培养基通入已灭过菌的发酵罐的灭菌方式。●对数残留定律：在微生物死亡过程中的任一时刻，活菌数的减少速率与该时刻残留的活菌数成正比，这就是微生物死亡的对数残留定律。微分式为：-dN/dτ=kN；积分式为：τ=（2,303/k）log(N0/Ns)N0开始灭菌时的活菌数Ns灭菌结束时残留菌数。●单种法：一个种子灌接种一只发酵罐的接种方法。●双种法：用两只种子灌接种一只发酵罐的接种方法。●倒种法：从一只发酵罐中倒出适宜的，适量的发酵液给另一个发酵罐做种子的方法。●生长关联型：产物生成与菌体生长之间有平行的准量关系。这样的产品或为菌体本身或初级代谢产物。●部分生长关联型：菌体生长出现两个高峰，第一个生长高峰与产物合成无平行的准量关系，第二个生长高峰与产物合成有平行的准量关系。●非生长关联型：细胞生长与产物合成无平行的准量关系，只与菌体的总量有关。大部分次级代谢产物属于这一类。●凝聚：是在中性盐作用下，由于双电层排斥电位的降低，而使胶体体系不稳定的现象。絮凝：在某些高分子絮凝剂存在下，基于架桥作用，使胶粒形成粗大的絮凝团的过程，是一种以物理的集合为主的过程。●如何从一个菌种得到另一个菌种（如从生产菌种获得缺陷型）：①诱变剂处理：采用辐射、化学试剂等因素处理细菌。②淘汰野生型：抗生素法或菌丝过滤法。③检出缺陷型：用一个培养皿即可检出，有夹层培养法和限量补充培养法；在不同培养皿上分别进行对照和检出的有逐个捡出法和影印检出法。④鉴定缺陷型：可借生长谱法进行。●如何从土壤中筛选芽孢杆菌（微生物）采样---预处理---增殖培养---纯种分离---菌落选择---初筛---复筛---野生菌株---性能鉴定（生产性能试验、毒性试验、菌种鉴定）---菌种保藏采样用取样铲，将表层5cm左右的浮土除去，取5-25cm处的土样10～25?g，装入事先准准备好的塑料袋内扎好、编号并记录地点、土壤土质、植被名称、时间及其他环境条件。悬液稀释预处理从土壤中分离芽孢杆菌时,由于芽孢具有耐高温特性,100℃很难杀死,要在121℃才能彻底死亡。分离：培养基营养成分、PH、选择性抑制剂；培养：注意温度、PH、氧气需求及培养时间；菌落选择：铺菌法、复印法；复筛：生长速率、底物消耗、产物合成的测定。●菌种保藏原理、常用方法原理：菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点，人工创造条件，使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。一般可以通过保持培养基营养成分在最低水平，缺氧状态，干燥和低温，使菌种处于休眠状态，抑制其繁殖能力。常用方法：（1）斜面冰箱保藏法：三个月。（2）石蜡油封存法：六个月。（3）沙土管保藏法：产孢子或芽孢的微生物。（4）真空冷冻干燥保藏法：需要一定设备，要求比较严格。（5）液氮超低温保藏法：通常在微生物孢子或营养细胞培养物中加入20%的甘油，将其保存在液氮或-80℃冰箱中，可保藏数年而不死。●培养基主要营养成份及其生理功能培养基的成分：分为碳源、氮源、生长因子、无机盐及微量元素、水和能源。碳源，细胞及其产物的碳架结构和能量的来源。氮源：主要用于构成菌体细胞物质（如氨基酸、蛋白质、核酸等）和含氮代谢物等的氮素来源。生长因子：微生物代谢必不可少且不能用简单的碳源或氮源自行合成。无机盐元素：P、S、Ca、Mg、Na、K、Fe、Cl等。P：核酸、ATP辅酶、代谢中间体的组成成分。在代谢途径的调节方面，起着重要作用。S：蛋白质、辅酶、生物素、谷光甘肽等组成成分。是含硫氨基酸的组成成分和某些辅酶的活性基。Fe：细胞色素、过氧化氢酶的组成成分。Mg、Ca：酶的辅基、激活剂。K、Na：调节渗透压。微量元素：Zn、Co、Mn、Cu等，主要是酶的辅基和激活剂。水分：是营养物质，因为离开水生命活动即停止；参与代谢活动，如水解与合成多糖、蛋白质等均有水参加反应；是环境条件，许多反应需要在水中进行；是细胞物质的连续相。能源：为微生物提供生长代谢所需的能源。微生物根据其生理类群的不同，其能源物质也不同，有时能源物质是独立于碳源之外的。●发酵工业中常用碳源及其优缺点常用的碳源：糖类、油脂、有机酸、低碳醇、烃类。在特殊情况下（如碳源贫乏时），蛋白质水解产物或氨基酸等也可被某些菌种作为碳源使用。（1）糖类：a：速效碳源，如葡萄糖等。优点：易于利用。缺点：高浓度会造成抑制，利用过程中产酸速度快，使pH下降。但是过多的葡萄糖会过分加速菌体的呼吸，以致影响某些酶的活性，从而抑制微生物的生长和产物的合成。b.长效碳源，如淀粉等，优点是长效，边糖化边利用，不会造成高浓度抑制，且价格较便宜。缺点是增大培养基的粘度且有些微生物不具有淀粉酶和糖化酶，不能利用这类碳源。（2）油脂:优点是高还原态能源和碳源，同时也是消沫剂。缺点是脂肪的分解利用，可造成有机酸积累，使培养液pH下降。（3）有机酸盐：如乙酸盐等，也可做速效碳源，缺点是成本较高，利用后pH上升。（4）醇类：如乙醇，低浓度是可被少数微生物作碳源，缺点是成本高。（5）烃类：石油微生物的碳源，其他微生物一般不能利用。近年来随着石油工业的发展，微生物工业的碳源也有所扩大，一些烃类物质已用于发酵工业中。●如何使培养基有一个适当的PH缓冲能力生理酸性、碱性盐和pH缓冲剂的加入和搭配，以使pH值在发酵过程中不易超过一定范围。（在微生物的生长、代谢过程中会产生引起培养基pH改变的代谢产物，如不及时调节，就会抑制甚至杀死其自身，因而在设计培养基时，就要考虑培养基成分对pH的调节能力。●培养基主要无机盐及其生理功能P：核酸、ATP辅酶、代谢中间体的组成成分。在代谢途径的调节方面，起着重要作用，有利于糖代谢的进行，能促进微生物的生长。S：蛋白质、辅酶、生物素、谷光甘肽等组成成分。硫存在于细胞的蛋白质中，是含硫氨基酸的组成成分和某些辅酶的活性基；Fe：细胞色素、过氧化氢酶的组成成分，是菌体有氧氧化必不可少的元素。Mg、Ca：酶的辅基、激活剂。K、Na：调节渗透压。与维持细胞的渗透压有关，是微生物发酵培养基的必要成分。Cl：在一般微生物中不具有营养作用，但对一些噬盐菌来讲是有用的。●开发一个菌株的培养基配方：1.研究思路与原则：A）先要了解该菌的营养类型和生态类型。B）确定培养基的类型和划定培养条件的范围。C）进行培养基成分与培养条件的选择：(a)要根据供试菌的营养需要，包括生长需要和合成产物的需要。(b)比例范围，如C：N比。(c)培养基物态。(d)pH缓冲能力。(e)培养温度。(f)溶氧。（g）原料价格、来源、加工方式。2.研究方案设计：（A）选择因子与水平，先选因子后选水平（B）选择适宜的正交表，或者响应面方法，如爬坡法。（C）填写表格，配制培养基，准备培养条件。（D）建立检验指标与方法。3.操作及注意事项：摇瓶规格要一致，培养基要准确。不能染菌。种子液要混匀，加量要准确。检验结果要准确。4.计算与分析：确定培养基配方与环境条件控制指标。5.验证试验与适当调整●分批灭菌的简要步骤分批灭菌的操作要点a)配料：将培养基在配制罐中配好后，通过专用管道输入发酵罐中。b)升温阶段：开动搅拌系统，先用夹套或蛇管预热(尾气开)，当温度升温到90-100℃时，停止搅拌，三路进气，同时三路排气。升温过程应尽可能快一些，以利于营养物质的保持。c)保温阶段：温度达到预定温度后，关小进汽、排汽阀门，按照罐温变化情况调节各路进汽与排汽量，使罐温维持在预定灭菌温度之上1~2度范围内。d)冷却阶段：灭菌时间达到后，关闭所有与发酵罐直接相通的阀门，立即引入无菌空气保压，开搅拌、排气阀，引入冷却水冷却。●典型空气除菌的工艺流程：采气---前置过滤器---空压机---储气管---冷却器---油水分离器---加热器---总过滤器---分过滤器---发酵罐a)采气：高度每上升10米，含菌数下降一个数量级，因此最好采集一定高度的空气。b)前置过滤：除去大颗粒沙土、纤维等杂物，以防损伤空压机。c)空压机：这是一个空气驱动设备，需要的能耗很大。d)储气罐：消除往复式空压机产生的气流脉冲。e)冷却器：空气经冷却后才能通入发酵罐。f)油水分离器：冷却后的空气温度低于漏点后，即有水滴析出。g)加热器：通过加温使相对湿度降下来。h)总过滤器：为过滤除菌的主要设备，i)分过滤器：为了保险起见，还要进行一次过滤。则空气的无菌度、温度、湿度即可达到要求。●常用的灭菌方法及其适应性如何（1）化学灭菌：一些化学药剂能使微生物中的蛋白质、酶及核酸发生反应而具有杀菌作用。常用的化学药剂有甲醛、氯、高锰酸钾等。化学灭菌法不用于培养基的灭菌。但染菌后的培养基可以用化学药剂处理。（2）射线灭菌：利用紫外线、高能电磁波或放射性物质产生的γ射线进行灭菌的方法。最但紫外线的穿透力低，所以仅用于表面消毒和空气的消毒。微波灭菌设备的兴起，为灭菌提供了新的选择。（3）干热灭菌：干热灭菌常用的干热条件为在160℃下保温1h：干热灭菌不如湿热灭菌有效。一些要求保持干燥的实验器具和材料(如培养皿、接种针等)可以用于热灭菌，（4）湿热灭菌：湿热灭菌即利用饱和水蒸气进行灭菌。容易使蛋白质凝固而杀火各种微生物，同时，蒸汽的价格低廉，来源方便，灭菌效果可靠。所以培养基灭菌、发酵设备及管道的灭菌，普遍采用湿热灭菌。（5）过滤除菌：过滤除菌即利用过滤方法截留微生物，达到除菌的目的。只适用于澄清流体的除菌。●如何判断菌种的质量。A）pH；B)菌体形态（染色镜检：形态均一，染色均一，深色较健康。如：酵母菌，丝状真菌边缘的光滑完整程度，如果在液态培养中如果分支较多则比较健康）、浓度（需要在小的范围内波动）；C)培养基外观、气味（凭经验来看）；D)产物含量、酶活力；E)无杂菌●生长关联型、