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第三章蛋白质组研究方法Chapter3ResearchMethodsinProteomics主要内容蛋白质研究方法的概述大规模的蛋白质分离技术高通量蛋白质鉴定技术第一节概述一、蛋白质组的研究远比基因组的研究要复杂的多蛋白质的数目远大于基因的数目:基因的拼接和翻译后修饰蛋白质是动态/基因是相对静态的氨基酸种类远多于核苷酸种类技术手段上:基因研究有PCR、DNA自动测序技术、DNA微阵列技术等;蛋白质没有相匹配的技术DNA蛋白质检测水平/灵敏度可用PCR技术扩增检测限约为30个拷贝/样本无法被扩增检测方法高度特异DNA与其互补序列(DNA/RNA)的杂交能力使得DNA很容易固相化在靶上并用荧光探针检测。高密度阵列检测专用的扫描仪已经出现非特异蛋白质可以用非特异的方法如蛋白染色或较特异的方法如抗体进行检测分子的稳定性DNA是非常稳定的,即使在提高温度的情况下也不丢失生物活性蛋白质在变性情况下将丧失天然功能,需要格外小心保持其天然构象重复性重复性好将DNA固相化在表面已经是成熟的技术,加之DNA固有的稳定性,方法的重复性较好重复性不好由于蛋白质分子的稳定性不好,方法的重复性需格外关注消耗初始的投入是较大的(微阵列、扫描仪、共聚焦显微镜),但短期内得到的数据量相当大目前的蛋白质分析方法依赖昂贵的仪器设备(质谱仪、2-DE装置)专业化方法已相当标准化蛋白质的分析较困难。大部分分析工作如纯化与质谱分析等都需要受过训练的人员来操作时间/自动化已成为高通量的扫描技术目前还不能达到工业需求的高通量翻译后修饰无法研究研究翻译后修饰的唯一方法是研究蛋白质本身动态范围5个数量级7-12个数量级DNA分析(cDNA微阵列)与蛋白质分析(2-DE与质谱)方法的比较二、蛋白质研究技术的发展双向电泳技术:1975年,O’Farrel建立的;是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术,一般能分离1000–3000个蛋白质点图像分析与大规模数据处理软件两种软电离质谱技术-基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrixassistedlaserdesorptionionizationtimeofflightmassspectrometry,MALDI-TOF-MS)与电喷雾电离质谱(electro-sprayionizationmassspectrometry,ESI-MS):可精确测定生物大分子的相对分子质量及多肽序列,使得微量快速的蛋白质鉴定得以实现双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术、质谱技术---蛋白质组研究的三大基本支撑技术。三、蛋白质组研究步骤2-D电泳高效柱层析分离蛋白质氨基酸组成分析、C-端或N-端氨基酸序列分析及MS鉴定所分离的蛋白质生物信息学数据库对鉴定结果进行存储、处理、对比和分析蛋白样品的IEF和PAGE电泳分离生物学问题的提出实验模型的设计实验组和对照组样品的制备图像扫描和初步分析感兴趣蛋白点的切取胰酶对脱色后蛋白质的消化质谱的多肽指纹图、微测序分析质谱结果的生物信息学分析和比对新蛋白质的发现其它实验的进一步验证蛋白信息的初步获得蛋白质组研究策略蛋白质组研究的基本技术路线凝胶中的蛋白胶上原位酶切蛋白质组数据库蛋白质样品的制备(细胞、组织、体液)双向电泳图像分析、数据处理电转印至膜上的蛋白混合肽氨基酸分析、氨基酸组成Edman降解、N端测序肽序列标签肽质量指纹图数据库检索蛋白质鉴定MALDI-TOF-MSESI-MS-MS寡核苷酸合成基因蛋白实验蛋白活性免疫组化蛋白定位抗体肽合成四、新的蛋白质组研究技术定量蛋白质组学研究:同位素编码亲和标签技术(isotope-codedaffinitytags,ICAT)和双色荧光技术等蛋白质相互作用:酵母双杂交技术、蛋白质复合物免疫分离与质谱鉴定技术;蛋白质分离于鉴定:多维色谱-质谱联用技术翻译后修饰:蛋白质图谱展示与检测技术蛋白质表达:蛋白质芯片技术第二节大规模的蛋白质分离技术蛋白质组学的目的:实现对一个基因组所编码的全部蛋白质及其相互作用的研究首要问题:蛋白质的有效分离理想的蛋白质分离方法:超高分辨率;可针对不同类型的蛋白质一、二维凝胶电泳1.2-DE的介绍:是目前唯一能够将数千种蛋白同时分离与展示的技术1.1在2-DE中,蛋白质首先根据等电点的不同,在一向等电聚焦电泳中分离,接着被转移到二向SDS-聚丙稀酰胺凝胶上,再根据相对分子质量大小不同被分离1.2固相化pH梯度(immobilizedpHgradient,IPG)等电聚焦电泳技术;微量鉴定技术以及质谱技术灵敏度的提高1.3不足:膜蛋白、碱性蛋白、低丰度蛋白的分离与检测;重复性以及规模化和自动化的问题等1.4改进:2-DE样品的前处理;2-DE后的蛋白点的检测研究等第一向进行等电聚焦(isoelectricfocusing,IEF),由于蛋白质具有两性解离和等电点特性,将蛋白质样品加载至pH梯度介质上进行电泳时,会向与其所带电荷相反的电极方向移动。移动过程中,蛋白分子可能获得或失去质子,并随着移动的进行,该蛋白所带的电荷数和迁移速度下降。当蛋白迁移至其等电点pH位置时,其净电荷数为零,在电场中不再移动。根据各自不同的等电点,蛋白质最终被聚焦在一个很窄的pH梯度介质区域内。目前常使用预制胶条(IPG)用于蛋白质的等电聚焦分离,将聚焦好的IPG胶条在含有SDS的缓冲液中平衡第二向是将在IPG胶条中经过第一向分离的蛋白质转移到SDS-PAGE凝胶上,根据蛋白质的相对质量或分子量大小与第一向相垂直的分离。样品经过电荷和质量两次分离后,得到等电点和分子量的信息2.低丰度蛋白、膜蛋白的检测与样品预分离2.1低丰度蛋白大部分的蛋白质是低丰度的蛋白质,而低丰度的蛋白质往往是执行重要生物功能的蛋白质密码子偏性(codonbias):指生物体中编码同一种氨基酸的同义密码子的非均衡使用现象。密码子偏性系数(codonbiasindex):CBI小于0.2的基因编码的蛋白质为低丰度蛋白质。酵母中2500个编码基因的CBI小于0.1。一步法(one-extract-one-gel):一步提取的细胞总蛋白在一块胶上进行电泳分离;高丰度蛋白加大上样量,但有限制窄范围的IPG胶条(2-3个pH单位)、非常窄范围的IPG胶条(约1个pH单位):可以增加电泳胶的分辨率,加大样品的负载量,但存在超出pH范围的蛋白去除高丰度的蛋白质蛋白质的检出限预染色方法、起始加样量的关系银染(1ng)考马斯亮蓝染(100ng)蛋白质的丰度拷贝数/细胞蛋白质的量mg细胞数蛋白质的量mg细胞数1020.0731.2×1092007.31.2×10111002.0071.2×108200.71.2×101010000.2011.2×10720.11.2×109100000.0201.2×1062.01.2×1081000000.0021.2×1050.21.2×107以6×107个细胞得到1mg可溶酵母蛋白计算。2.2膜蛋白膜蛋白是一些疏水性的蛋白质,在常规2-DE的提取液中的溶解度低,另外因聚焦而产生浓缩、聚集,从而使得膜蛋白很难融解并进入二向SDS-PAGE电泳,因此很难被检测到2.3样品预分离(pre-fractionation)2.3.1分步提取法(sequentialextraction)原理:蛋白质的溶解度差异采用3种不同的提取液进行分步提取和分别电泳;实际上是增加了融解性能不同的第三维分离2.3.2多间隔电离法(multi-compartmentelectrolyser)实质上是一种制备等电聚焦的方法。电泳装置由中间的聚焦室和两端的电极室组成。聚焦室由隔膜分成多个样品室。电极室内装电极,由阴阳离子交换膜将电解质与样品分开。操作时,将预分离的蛋白质混合物放进聚焦室中,随着等电聚焦电泳的进行,混合物中的蛋白质根据各自的等电点不同而聚焦到相应的样品室中并被分别收集多间隔电离法示意图3.碱性蛋白质的分离与检测3.1很难被分开:商业化的IPG胶条的pH范围通常在3-10,等电点超过10的蛋白质很难被分开。目前已经有pH范围到12的IPG胶条,从而得到了部分的解决3.2大部分的细胞提取物是酸性蛋白质:去除酸性蛋白质改善碱性蛋白质的分离与检测。可以采用刚才介绍的方法,制备等电聚焦预分离,将碱性蛋白质富集,再采用碱性pH梯度胶进行分离4.IPG胶条的改进4.1胶条的pH范围在不断变窄:改善了2-DE的分辨率,增加了上样量,从而提高了蛋白质的检出,而且可以针对不同样品选择不同的胶条4.2胶条的pH范围也在不断扩大:改善了碱性蛋白质的分离4.3不同长度的胶条:通常采用的是18cm的胶条,可以达到2000种以上蛋白质点的分辨率;24cm、40cm5.高通量与自动化5.1蛋白质组研究的高通量需要研究体系的自动化:集中在2-DE后的样品处理和蛋白质的识别5.2自动点切割仪,自动样品处理机等:减少了手工操作,缩短了时间,提高了效率;提高了样品处理的重复性,避免了手工操作易产生的污染5.3可同时运行12块胶的二向SDS-PAGE电泳槽已经研制成功并商品化2-DE,染色,图像分析自动MS样品分析自动蛋白酶解,多肽回收,点样于MS样品靶自动采集数据,数据库检索,蛋白鉴定胶上蛋白点自动切割,置于96或384孔板蛋白质识别过程的自动化流程5.4分子扫描(molecularscanner):将一个固相化了胰蛋白酶的PVDF膜插入2-DE电泳胶和另一个PVDF膜之间,后一个PVDF膜作为收集膜。当对上述体系进行电转印时,胶上的蛋白质在向第一个PVDF膜迁移的过程中被胰蛋白酶酶切,酶切肽段穿过带有固相化胰酶的PVDF膜,被第二个PVDF膜收集。收集膜可直接用于MALDI-TOF-MS做肽质量指纹谱分析。实现了2-DE后的样品处理与质谱分析一体化;肽段数目低,使蛋白质特别是翻译后修饰蛋白质的识别与鉴定效率受到影响。6.2-DE的局限性实验设计:样本间的异质性以及组织中多种细胞的并存,将影响实验结果的可靠性。激光捕获显微切割的方法(laser-capturemicrodissection,LCM):单一细胞重复性:是2-DE方法存在的主要问题动态范围:有限的动态范围与低拷贝蛋白质的难以检测也是2-DE目前尚未完全解决的问题。放射性同位素标记激光捕获显微切割示意图蛋白质的丢失:疏水性蛋白质、分子质量大于100kDa的蛋白质通量和自动化:图像分析仍然是瓶颈二、色谱-质谱技术1.二维色谱-串连质谱技术(2D-HPLC-MS-MS)1.1二维色谱分离蛋白质和多肽优点缺点2-DE高分辨率,1000个蛋白质可得到等电点、相当分子质量信息可得到蛋白质表达谱可平行运行多个胶费时、费力;不易自动化疏水、酸性、碱性、10kDa、200kDa蛋白易丢失样品负载量受限制2D-HPLC快速可分离各种蛋白质易于自动化样品在液相;馏分易收集可做样品制备或浓缩不能得到等电点、相对分子质量信息尚未实现平行操作不易得到蛋白质表达谱分辨率不够高2-DE与2D-HPLC的比较二维色谱分离蛋白质的优势:快速;可分离各种蛋白质;样品在液相,馏分易收集;易于自动化;可做样品制备或浓缩二维色谱分离蛋白质有多种组合模式:第一维色谱一般是离子交换色谱/凝胶过滤色谱,第二维通常是反相色谱scx阳离子交换柱2D-HPLC分离体系示意图缓冲液废液样品反相柱检测器洗液-流动相反相柱1反相柱2流动相废液10通道切换阀1.2二维色谱-串连质谱分离鉴定细胞蛋白质采用二维色谱-串连质谱技术可以对蛋白质混合物进行直接分离与鉴定。样本蛋白质混合物---蛋白酶裂解---二维色谱分离---质谱分析鉴定蛋白质色谱反相柱质谱仪串连质谱测序数据库检索匹配蛋白质鉴定蛋白质混合物二维色谱/质谱分析流程样品优势:识别和鉴定低丰度蛋白、膜蛋白、酸性蛋白、碱性蛋白以及相对分子质量大的蛋白质不足:通过蛋白质直接酶切得到的肽段混合物过于复杂,较难实现对细胞全部蛋白质的识别与鉴定2.同位素标记
本文标题:3 蛋白质组研究技术
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