CRISPRCas9植物基因敲除

CRISPR-Cas9植物基因敲除试剂盒说明书Cat.No.GP0138ProtocolNo.PT140730-1出版日期July.2014南京市汉中门大街301号南京国际服务外包产业园01栋13层A座电话：[phone]传真：[phone]邮编：210036网址：订购&技术咨询客服/订购技术支持Telephone:[phone]Telephone:[phone]Fax:[phone]Fax:[phone]Web::[e-mail]-mail:[e-mail]-Cas9植物基因敲除试剂盒ProtocolNo.PT140730-1目录I．组份列表………………………………………………………………………………..……….…2II．产品概要………………………………………………….….…………………………….………2III．操作步骤…………………………………………………….………………………………..…..31.设计OligoDNA序列………………………………………………………………………..32.线性化pP1C.2载体………………………………………………………………………...…33.重组pP1C.2载体的构建………………………………………………………………...……34.重组pP1C.1载体的构建…………………………………………………………….………..3IV．附录pP1C系统质粒图谱……………..…………………….…….………………...…………4-5V．参考文献…………………………………..…….……………….…….…………..…...………6图Figure1.CRISPR-Cas9工作原理示意图Figure2.pP1C.1质粒图谱Figure3.pP1C.2质粒图谱表Table1.CRISPR-Cas9植物基因敲除试剂盒组份列表CRISPR-Cas9植物基因敲除试剂盒ProtocolNo.PT140730-1．组份列表CRISPR-Cas9基因敲除试剂盒组份如下：Table1.CRISPR-Cas9植物基因敲除试剂盒组份列表组份列表含量pP1C.1Vector2μgpP1C.2Vector2μg贮存条件※注意：在收到货后，请您将pP1C.1Vector和pP1C.2Vector瞬时离心后再保存。将pP1C.1Vector、pP1C.2Vector置于-20℃保存，且避免污染；II．产品概要CRISPR/Cas9植物基因敲除试剂盒是一款高效、精准的基因编辑试剂盒，它是基于最新代的人工核酸内切酶CRISPR-Cas9而研发的，相对于传统敲除技术和TALENs\ZFNs技术而言，其操作更加简便，敲除效率最高，基因的编辑更加的精准，大大降低了脱靶机率。CRISPR/Cas9植物基因敲除试剂盒能够适用于几乎所有植物细胞的基因修饰研究。pP1C系列载体是CRISPR/Cas9系统在植物中应用的载体，支持使用农杆菌介导进行的随机整合以及原生质体共转的瞬时表达系统。pP1C载体系列中使用的Cas9基因及其核定位信号已经文献报道能够正常发挥其作用，并在水稻等植物中得到实践。限于CRISPR系统中trancrRNA的结构需要，以及pP1C载体中结构限制，难以将所有元件置于一个载体中并使其易于操作，因此，每一套pP1C载体至少包含两个载体，如pP1C.1、pP1C.2。Genloci公司为您提供完整的基因敲除解决方案，从敲除方案设计→敲除位点设计→载体构建→转染→敲除检测→结果分析，让您的实验一次成功！Figure1.CRISPR-Cas9工作原理示意图CRISPR-Cas9植物基因敲除试剂盒ProtocolNo.PT140730-1．操作步骤实验前，请您务必做好以下验证实验：A．目的基因的表达情况分析，为防止因染色体缺失等情况导致靶基因缺失，首先需要PCR扩增靶基因，并对PCR结果进行测序，确保靶基因的完整存在；其次，您还可以用RT-PCR分析靶基因的活跃度。1.设计OligoDNA序列首先，您需要在靶标DNA区域中设计一对20bp左右的oligoDNA，您可以通过以下在线工具设计：●麻省理工学院的CRISPRDesign：●德国癌症研究中心的E-Crisp：引物合成模板：上游：5’_GCAA（20bp靶位点正向）_3’下游：3’_（20bp靶位点反向）-CAAA_5’其中上游的GCAA，下游的CAAA为BbsI酶切形成的粘性末端。示例：正链oligo：GCAATGTACGGGAGGGACCCGTGC负链oligo：AAACCACGGGTCCCTCCCGTACAG将设计后的序列送到值得信赖的公司合成，纯化级别为PAGE。2.线性化pP1C.2载体使用BbsI酶切pP1C.2（氨苄抗性）载体，回收3.2kb的片段；3.重组pP1C.2载体的构建将正负链oligos（100μM）等比例混合后，加热到95℃，3min，自然冷却至40℃以下，制备得到双链DNA；将双链DNA与酶切纯化后的pP1C.2载体片段连接、转化大肠杆菌，构建得到重组pP1C.2载体。对重组载体进行测序，确认插入序列的正确性。然后EcoRI、NheI双酶切重组载体pP1C.2，回收约520bp的DNA片段；4.重组pP1C.1载体的构建使用EcoRI、XbaI双酶切pP1C.1（卡那霉素抗性）载体，回收载体片段；将步骤3中得到的520bpDNA片段与酶切后的pP1C.1进行T4DNA酶连接，转化大肠杆菌，得到重组载体pP1C.1，重组载体pP1C.1即为构建好的CRISPR-Cas9植物基因敲除载体。后续可进行重组载体pP1C.1转化农杆菌，农杆菌介导植物转化，筛选阳性克隆，测序验证，敲除效率检测及敲除序列比对分析等。CRISPR-Cas9植物基因敲除试剂盒ProtocolNo.PT140730-1．附录pP1C系列质粒图谱Figure2.pP1C.1质粒图谱pP1C.1部分序列（片段转移位置）5’-……GGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACC……-3’EcoRI位点：GAATTCXbaI位点：TCTAGACRISPR-Cas9植物基因敲除试剂盒ProtocolNo.PT140730-1质粒图谱pP1C.2部分序列（靶点插入位置）5’-……CATGAAGCCTTTCAGGACATGTATTGCAGTATGGGCCGGCCCATTACGCAATTGGACGACAACAAAGACTAGTATTAGTACCACCTCGGCTATCCACATAGATCAAAGCTGATTTAAAAGAGTTGTGCAGATGATCCGTGGCAAgggtcttcgagaagacctGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTAGAGCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCTACCGGACTCAGATCTCGAGCTCAAGCTTCGAATTCTGCAGTCGACGGTACCCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTAACTAGAGATCTAGAGTCGAC……-3’转录起始位点：A双BbsI位点：gggtcttcgagaagacct绿色标示的序列：sgRNA（trancrRNA）EcoRI位点：GAATTCXbaI位点：TCTAGACRISPR-Cas9植物基因敲除试剂盒ProtocolNo.PT140730-1参考文献1.Jinek,M.,Chylinski,K.,Fonfara,I.,Hauer,M.,Doudna,J.A.,andCharpentieE.Aprogrammabledual-RNA-guidedDNAendonucleaseinadaptivbacterialimmunity.Science,2012,337:816～821.2.HorvathP.,BarrangouR.CRISPR/Cas,theimmunesystemofbacteriaandarchaea.Science,2010,327(5962):167～170.3.HaleCR,ZhaoP.,OlsonS.,etal.RNA-GuidedRNACleavagebyaCRISPRRNA-CasProteinComplex.Cell,2009,139(5):945～956.4.ZhangF.,etal.MultiplexGenomeEngineeringUsingCRISPR/CasSystems.Science,2013,339(6121):819～8235.WestraER.,SwartsDC.,StaalsRH.,JoreMM.,BrounsSJ.,vanderOostJ.TheCRISPRs,theyarea-changin':howprokaryotesgenerateadaptiveimmunity.AnnuRevGenet,2012,46:311～339.6.MarraffiniLA.,SontheimerEJ.CRISPRinterference:RNA-directedadaptiveimmunityinbacteriaandarchaea.NatureRevGenet,2010,11(3):181～190.7.Jiang,W.,Bikard,D.,Cox,D.,Zhang,F.,andMarraffini,L.A.RNA-guidededitingofbacterialgenomesusingCRISPR-Cassystems.NatureBiotechnology,2013,31:233～239.8.HwangWY.,FuY.,ReyonD.,MaederML.,TsaiSQ.,SanderJD.,PetersonRT.,YehJR.,JoungJK.EfficientgenomeeditinginzebrafishusingaCRISPR-Cassystem.NatureBiotechnology,2013,31:227～2299.LiuP,LongL,XiongK,YuB,ChangN,XiongJW,ZhuZ,LiuD.Heritable/conditionalgenomeeditinginC.elegansusingaCRISPR-Cas9feedingsystem.CellResearch.2014,2