双脱氧末端终止测序法原理过程和目标基因cDNA序列拼接

1双脱氧末端终止法测序的原理、过程和目标基因序列的分析教师：程琳2011年11月分子生物学实验2实验目的1、通过本实验了解双脱氧链终止法的基本原理，掌握DNA测序的基本方法；2、学会序列查询、核酸及蛋白质的同源性搜索和比对。3DNA测序技术主要有两种方法，都是在20世纪70年代中期发明的。•A.双脱氧链终止法（thechainterminationmethod），是通过合成与单链DNA互补的多核苷酸链来读取待测DNA分子的顺序。•B.化学降解法（chemicaldegradationmethod），是将双链DNA分子用化学试剂处理，产生切口，用同位素标记进行测序。一、DNA测序的方法41.Sanger双脱氧链终止法测序原理利用DNA聚合酶和双脱氧链终止物测定DNA核苷酸顺序的方法，是由英国剑桥分子生物学实验室的生物化学家F.Sanger等人于1977年发明的。5基本原理：聚丙烯酰胺凝胶电泳可以区分长度只差一个核苷酸的DNA分子；利用DNA聚合酶不能够区分dNTP和ddNTP的特性，使ddNTP参入到寡核苷酸链的3’-末端。因为ddNTP3’不是-OH，不能与下一个核苷酸聚合延伸，从而终止DNA链的增长。672、具体操作：测序时分成四个反应,每个反应除上述成分外分别加入2,3-双脱氧的A,C,G,T核苷三磷酸（称为ddATP,ddCTP,ddGTP,ddTTP）,然后进行聚合反应。在第一个反应中,ddATP会随机地代替dATP参加反应，一旦ddATP加入了新合成的DNA链，由于其第3位的-OH变成了-H,所以不能继续延伸,于是第一个反应中所产生的DNA链都是到A就终止了。8同理第二个反应产生的都是以C结尾的;第三个反应的都以G结尾,第四个反应的都以T结尾,电泳后就可以读出序列了.9假如有一个DNA,互补序列是GATCCGAT,我们试着做一下:在第一个反应中由于含有dNTP+ddATP,所以遇到G,T,C三个碱基时没什么问题,但遇到A时,掺入的可能是dATP或ddATP,比如已合成到G,下一个如果参与反应的是ddATP则终止,产生一个仅有2个核苷酸的序列:GA,否则继续延伸,可以产生序列GATCCG,又到了下一个A了.同样有两种情况,如果是ddATP掺入,则产生的序列是GATCCGA,延伸终止,否则可以继续延伸,产生GATCCGAT.将得到如下结果：1产生的都是以A结尾的片段:GA,GATCCGA。234产生的都是以C结尾的片段:GATC,GATCC产生的都是以G结尾的片段:G,GATCCG产生的都是以T结尾的片段:GAT,GATCCGAT10制得的四组混合物全部平行地点加在变性聚丙烯酸受凝胶电泳板上进行电泳，每组制品中的各个组分将按其链长的不同得到分离，从而制得相应的放射性自显影图谱。从所得图谱即可直接读得DNA的碱基序列。即可得到测序结果：为GATCCGAT11制备单链模板↓将单链模板与一小段引物退火↓加入DNA多聚酶4种脱氧核苷酸分别加入少量4种双脱氧核苷酸↓将4种反应产物分别在4条泳道电泳↓根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列3、技术路线：124、高通量自动化测序DNA序列分析自动化包括两个方面的内容，一方面是指“分析反应”的自动化，另一方面是指“读片过程”的自动化。自动化的DNA序列分析，也是根据Sanger双脱氧链终止DNA测序法的基本原理发展起来的。13自动化测序原理自动化测序类似于PCR反应，但只用一条引物，反应混合物中含有不同荧光标记的ddNTP与4种dNTP。由于每种ddNTP带有各自特定的荧光颜色,而简化为由1个泳道同时判读4种碱基。产物条带经过检测仪时给出特定信号，由计算机判读并记录。优点：可用双链DNA做模板；模板用量少，不必克隆；可实现高通量自动化。14高速自动DNA测序仪的结构及工作原理由激光发射器产生的激光束，通过精密的光学系统后被导向凝胶表面的检测区。在此，激光束垂直射向凝胶，同经过检测孔的DNA片段发生作用，并提供能量激发荧光发色基团发射出具特异性波长的荧光。这些荧光通过聚焦镜集中后传给滤光镜/棱镜组件，以便四种碱基产生的不同标记波长区别开来。经成像透像最后由高灵敏度的相机分段收集信号，传送给计算所分析处理。15荧光化合物标记链终止法以荧光颜色为标记信号，每种ddNTP各有1种代表颜色；整个反应在一个试管中进行；当新合成的终止单链通过荧光监测仪时，可由光信号读出末端核苷酸并由电脑记录。1617Sanger双脱氧链终止DNA测序法的测序能力：手工测序：最大约300bp；自动测序：最大约1200bp。18二、序列比对分析1.相似性与同源性•相似性(similarity)：是指一种很直接的数量关系，比如部分相同或相似的百分比或其它一些合适的度量。比如说，A序列和B序列的相似性是80％，或者4/5。这是个量化的关系。当然可进行自身局部比较。19•同源性(homology)：指从一些数据中推断出的两个基因或蛋白质序列具而共同祖先的结论，属于质的判断。就是说A和B的关系上，只有是同源序列，或者非同源序列两种关系。而说A和B的同源性为80％都是不科学的。20序列的相似性和序列的同源性有一定的关系，一般来说序列间的相似性越高的话，它们是同源序列的可能性就更高，所以经常可以通过序列的相似性来推测序列是否同源。正因为存在这样的关系，很多时候对序列的相似性和同源性就没有做很明显的区分，造成经常等价混用两个名词。所以有出现A序列和B序列的同源性为80％一说。21序列相似性比较：就是将待研究序列与DNA或蛋白质序列库进行比较，用于确定该序列的生物属性，也就是找出与此序列相似的已知序列是什么。完成这一工作只需要使用两两序列比较算法。常用的程序包有BLAST、FASTA等；22序列同源性分析：是将待研究序列加入到一组与之同源，但来自不同物种的序列中进行多序列同时比较，以确定该序列与其它序列间的同源性大小。这是理论分析方法中最关键的一步。完成这一工作必须使用多序列比较算法。常用的程序包有CLUSTAL等；232.Blast简介及应用（1）Blast简介BLAST是由美国国立生物技术信息中心（NCBI）开发的一个基于序列相似性的数据库搜索程序。BLAST是“局部相似性基本查询工具”（BasicLocalAlignmentSearchTool）的缩写。24Blast是一个序列相似性搜索的程序包，其中包含了很多个独立的程序，这些程序是根据查询的对象和数据库的不同来定义的。比如说查询的序列为核酸，查询数据库亦为核酸序列数据库，那么就应该选择blastn程序。下表列出了主要的blast程序：25主要的blast程序程序名查询序列数据库搜索方法Blastn核酸核酸核酸序列搜索逐一核酸数据库中的序列Blastp蛋白质蛋白质蛋白质序列搜索逐一蛋白质数据库中的序列Blastx核酸蛋白质核酸序列6框翻译成蛋白质序列后和蛋白质数据库中的序列逐一搜索。Tblastn蛋白质核酸蛋白质序列和核酸数据库中的核酸序列6框翻译后的蛋白质序列逐一比对。TBlastx核酸核酸核酸序列6框翻译成蛋白质序列，再和核酸数据库中的核酸序列6框翻译成的蛋白质序列逐一进行比对。26（2）Blast资源1、NCBI主站点：（网络版）（单机版）2、其他站点：://nema.cap.ed.ac.uk/ncbi_blast.html（果蝇）…27Blast结果会列出跟查询序列相似性比较高，符合限定要求的序列结果，根据这些结果可以获取以下一些信息：1.查询序列可能具有某种功能；2.查询序列可能是来源于某个物种；3.查询序列可能是某种功能基因的同源基因；…这些信息都可以应用到后续分析中。28（3）Blast应用登陆ncbi的blast主页核酸序列蛋白序列翻译序列底下有其他一些针对特殊数据库的和查看以往的比对结果等29Blast任务提交表单11.序列信息部分填入查询（query）的序列序列范围（默认全部）选择搜索数据库如果接受其他参数默认设置，点击开始搜索30Blast任务提交表单2设置搜索的范围，entrez关键词，或者选择特定物种2.设置各种参数部分一些过滤选项，包括简单重复序列，人类基因组中的重复序列E值上限窗口大小如果你对blast的命令行选项熟悉的话，可以在这里加入更多的参数31Blast任务提交表单33.设置结果输出显示格式选择需要显示的选项以及显示的文件格式显示数目Alignment的显示方式筛选结果E值范围其他一些显示格式参数点击开始搜索32提交任务返回查询号（requestid）可以修改显示结果格式修改完显示格式后点击进入结果界面33结果页面1图形示意结果34结果页面2目标序列描述部分带有genbank的链接，点击可以进入相应的genbank序列匹配情况，分值，e值35结果页面3详细的比对上的序列的排列情况36（4）一个例子假设以下为一未知蛋白序列query_seqMSDNGPQSNQRSAPRITFGGPTDSTDNNQNGGRNGARPKQRRPQGLPNNTASWFTALTQHGKEELRFPRGQGVPINTNSGPDDQIGYYRRATRRVRGGDGKMKELSPRWYFYYLGTGPEASLPYGANKEGIVWVATEGALNTPKDHIGTRNPNNNAATVLQLPQGTTLPKGFYAEGSRGGSQASSRSSSRSRGNSRNSTPGSSRGNSPARMASGGGETALALLLLDRLNQLESKVSGKGQQQQGQTVTKKSAAEASKKPRQKRTATKQYNVTQAFGRRGPEQTQGNFGDQDLIRQGTDYKHWPQIAQFAPSASAFFGMSRIGMEVTPSGTWLTYHGAIKLDDKDPQFKDNVILLNKHIDAYKTFPPTEPKKDKKKKTDEAQPLPQRQKKQPTVTLLPAADMDDFSRQLQNSMSGASADSTQA我们通过blast搜索来获取一些这个序列的信息。37具体步骤：1.登陆blast主页根据数据类型，选择合适的程序3.填写表单信息4.提交任务5.查看和分析结果381.登陆ncbi的blast主页2.选择程序，因为查询序列是蛋白序列可以选择blastp，点击进入也可以选择tblastn作为演示，我们这里选blastp393.填入序列（copy＋paste）Fasta格式，或者纯序列4.选择搜索区域，这里我们要搜索整个序列，不填5.选择搜索数据库，这里我们选nr(非冗余的蛋白序列库)。是否搜索保守区域数据库（cdd），蛋白序列搜索才有。我们选上406.限制条件，我们限制在病毒里面找。7.其他选项保持默认值打分矩阵418.输出格式选项保持默认值9.点击开始搜索4210.查询序列的一些相关信息在cdd库里面找到两个保守区域，点击可以进入43图形结果44匹配序列列表45具体匹配情况46思考题1.序列的同源性和相似性有什么区别？2.在网上查询一个序列信息的步骤有哪些？