lc-ms定量分析流程与经验

美国应用生物系统中国公司应用技术服务部LC-MS/MS定量分析流程与经验2Date|ABCONFIDENTIALOpportunitiesintheServicesandSystemSolutionsMarket©2006AppliedBiosystems第一步：Q1SCAN——确定母离子的质荷比●根据待测化合物性质，选择分析的极性(＋/－)、离子化方式(ESI/APCI)，根据分子量选择扫描范围和时间●确定母离子的质荷比，准确到小数点后一位。参数设置：扫描方式：Q1Scan质量范围：ParameterRange，100～MW+30，t=1～2secCenterWidth，MW±5Da，t=0.5sec通过手动调节DP、GS1，使喷雾平稳、有效3Date|ABCONFIDENTIALOpportunitiesintheServicesandSystemSolutionsMarket©2006AppliedBiosystems第二步：ProductIonScan——确定子离子的质荷比●得到高质量的MS2图，母离子的强度为图谱中基峰强度的1/3到1/4为宜●平滑后选择子离子质荷比，确定到小数点后一位参数设置扫描方式：ProductIonScan质量范围：ParameterRange，50～MW+10，t=1～2sec通过手动调节CE4Date|ABCONFIDENTIALOpportunitiesintheServicesandSystemSolutionsMarket©2006AppliedBiosystems第三步：优化化合物参数●根据前面选出的母、子离子，组建MRM离子对●选择多个离子对时，应合理分配每一对的分析时间●用“Ramp”，优化Compound项下各参数，以及Source项下CAD参数。各离子对应分别设定。●初步建立MRM方法●一般优化两次，以得到比较确切的结果5Date|ABCONFIDENTIALOpportunitiesintheServicesandSystemSolutionsMarket©2006AppliedBiosystems第四步：方法转化：将连续进样方法→LC-MS方法●关掉所有质谱分析界面，将现有质谱体系灭活，激活液相色谱、质谱设备。●单击Acquire中BuildAcquireMethod，打开上面保存过的MRM方法，添加设备：色谱泵、自动进样器等。●设置色谱同步。●设置色谱参数，分析时间一般为0.6～1min，流动相组成和流量与实际样品分析时相同；修改质谱分析时间，与色谱参数一致；设置GS1、GS2、TEM初始值为40、40、400左右，保存方法，例如：LC-MRM.dam。6Date|ABCONFIDENTIALOpportunitiesintheServicesandSystemSolutionsMarket©2006AppliedBiosystems第五步：FIA-优化Source参数●将前面用过的样品溶液稀释100～1000倍。●在Tune项下，双击QuantitativeOptimization，选择FIA分析，根据向导进行自动优化。不接色谱柱进行FIA定量优化●注意：需要优化的各可选值之间用“;”分隔。●当对源参数含义及设置比较清楚后，可以省略此步。7Date|ABCONFIDENTIALOpportunitiesintheServicesandSystemSolutionsMarket©2006AppliedBiosystems第六步：色谱条件优化●接好并平衡色谱柱，用适当浓度标准品考察分离情况●根据色谱分离情况，会设定梯度洗脱●MRM方式可以不必所有峰都基线分离，但要注意避开基质离子抑制的干扰●调整色谱流动相组成和流速，并相应调整源参数8Date|ABCONFIDENTIALOpportunitiesintheServicesandSystemSolutionsMarket©2006AppliedBiosystems第七步：标准工作曲线的制作●空白基质添加标准品，稀释成不同浓度●根据LC流动相组成，选择稀释液，配制实际样品，●编辑批处理文件，排列进样顺序●平衡MS离子源和色谱柱●LC-MS/MS采集数据9Date|ABCONFIDENTIALOpportunitiesintheServicesandSystemSolutionsMarket©2006AppliedBiosystems第八步：数据处理●标准曲线的制做●正确积分色谱图●有内标和无内标的计算方法●最后结果的打印、存贮、复制10Date|ABCONFIDENTIALOpportunitiesintheServicesandSystemSolutionsMarket©2006AppliedBiosystems11Date|ABCONFIDENTIALOpportunitiesintheServicesandSystemSolutionsMarket©2006AppliedBiosystems重复步骤-流程图多种方法同时编入批处理，清洗，降温，关机程序自动STANGBY。美国应用生物系统中国公司应用技术服务部成功定量分析的经验与体会13Date|ABCONFIDENTIALOpportunitiesintheServicesandSystemSolutionsMarket©2006AppliedBiosystems准备工作●查阅文献●做好样品前处理，萃取浓缩分离纯化●有条件的可先在HPLC上摸好LC条件，能够基本分离更好，缓冲体系符合MS要求●溶剂包括水的纯度，最好色谱纯以上●新的色谱柱可能要先冲洗很长时间才能干净,某些样品非常容易吸附在进样阀和管路中，用溶剂清洗●质谱仪须校准，预热时间要足够长，气流的稳定也很重要，液N气阀开度要注意，达到稳定程度14Date|ABCONFIDENTIALOpportunitiesintheServicesandSystemSolutionsMarket©2006AppliedBiosystemsMS条件优化——先定性后定量●首先，确定离子化方式：ESIorAPCI，POSorNEG●用10-100ppm的纯样，Q1SCAN察看存在哪些离子，要能够看到待测的母离子，应明显比周围的噪声离子高，通过改变DP,观察离子的增减,若为POS方式，看M+1，M+18，M+23等等,初步判断分子离子,如看不到则可能是浓度太低或离子化方式不合适，或选择的溶剂体系不合适●母离子选M+H,或M-H最好,但有时只有M+NH4,M+Na等,这样CAD能量可能需要高些,选择[M+H]+，还是+NH4，+Na等，要由化合物决定。加合离子若稳定，则可用，不稳定则可能需换流动相，但+H通常好些，所需碰撞能量低，灵敏度高；如含Cl可选择2个母离子峰15Date|ABCONFIDENTIALOpportunitiesintheServicesandSystemSolutionsMarket©2006AppliedBiosystems●SIM与MRM，单级Q只能SIM，MRM可看成2个SIM，选择性更好●再根据上一步确定的母离子进行PRODUCTSCAN，确保所有碎片离子都来自待测化合物，而不是溶液中的杂质，找出较强的碎片离子信息。还可改变CE，从中选定MRM需要测定的一对或更多离子对,为最后LC-MS/MS联用做准备●做PRODUCTSCAN时，注意小数点后的位数,MRM输入要准,灵敏度才高●先多选几个离子对，待出现基质干扰时可换，最后根据法规要求确定离子对数目●MRM方式优化仪器，通过优化仪器参数，使得母、子离子都达到一定强度水平，使MRM灵敏度最高。可先让仪器自动优化参数，然后再手动细致优化，只检测一对离子时根据TIC的强度来确定仪器参数，一次优化多对离子时，要根据每对离子的XIC强度来分别确定仪器参数16Date|ABCONFIDENTIALOpportunitiesintheServicesandSystemSolutionsMarket©2006AppliedBiosystems●先用注射泵优化COMPOUND项下面的参数，如DP、CE及CAD等，再接通LC，用FIA优化其他参数如温度，气流和IS电压及离子源位置，或接一个三通，样品仍由注射泵进入离子源，同时LC保持需要的流量.然后进行MRM测定。●CURTAINGAS在不降低灵敏度情况下尽量大些，雾化辅助加热气流不用太大，这样可以提高信噪比，保持信号稳定。●分辨率的选择：当样品较纯，Q3可选LOW，提高灵敏度，若选LOW后本底噪声太高则意义不大。17Date|ABCONFIDENTIALOpportunitiesintheServicesandSystemSolutionsMarket©2006AppliedBiosystemsLC条件优化：●色谱柱长度可根据分离的要求而定，定性可长些,定量在能有效排除干扰情况下尽量短,提高效率；内径最好选细径柱如2mm的,1mm的,IS可不分流,4.6mm柱用1ml流量时如不分流灵敏度还不是最佳,不如流量低时更好。流速高，峰形好●不同牌号色谱柱，效果很可能不同●PH的影响-正离子方式PH要低些，负离子方式PH要高些，除对离子化有影响外，还影响LC的峰形，以至定量误差。流动相加乙酸铵可适合大部分测定要求18Date|ABCONFIDENTIALOpportunitiesintheServicesandSystemSolutionsMarket©2006AppliedBiosystems●用流动相配的标样，初步优化确定LC条件是否合适●标准品工作液现配现做，尤其是较低浓度，时间长了可能因吸附分解等降低●进样顺序要先稀后浓●洗针液要常换，进过浓样后要进一针空白，检验是否有残留污染●顺序：纯样-添加样-实际样品●流动相液优化后，空白提取液配制标准再优化，看干扰，空白添加再提取后看回收率●用空白提取液配制标准样做曲线，准确，有效排除干扰因素19Date|ABCONFIDENTIALOpportunitiesintheServicesandSystemSolutionsMarket©2006AppliedBiosystems前处理方法的优化●LC，MS都优化还不行，改提取方法●离子抑制-改变前处理方法或LC条件●内标用法，药代动力学时多采用内标，选择原则：内标物与被测物的化学性质有区别时，要注意干扰基质对他们的离子化影响的不同，尽量选同系物。还可利用同位素标记●衍生化：有时有助于信号强，且稳定，例如硝基呋喃类，衍生化后容易测量。20Date|ABCONFIDENTIALOpportunitiesintheServicesandSystemSolutionsMarket©2006AppliedBiosystems数据处理●最低检出限，信噪比～3:1，定量限～10:1●同一物质几对离子的比例应相对恒定，误差不超过15%，峰面积比峰高准确●当浓度低，信号弱，自动积分不准时可对峰面积手动积分●平滑次数与峰宽因子、保留时间等设置都会影响积分值●曲线过零点时，可用4个点；不用，则要5个点●线性范围太宽，有时意义不大