EMSA原理简介

EMSA实验技术及方法简介实验简介凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA-electrophoreticmobilityshiftassay）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同，可是双链或者是单链。当检测如转录调控因子一类的DNA结合蛋白，可用纯化蛋白，部分纯化蛋白，或核细胞抽提液。在检测RNA结合蛋白时，依据目的RNA结合蛋白的位置，可用纯化或部分纯化的蛋白，也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段（特异），和其它非相关的片段（非特异），来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下，依据复合物的特点和强度来确定特异结合。凝胶迁移或电泳迁移率检测（ElectrophoreticMobilityShiftAssay,EMSA）是一种检测蛋白质和DNA序列相互结合的技术，最初用于研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用，可用于定性和定量分析。这一技术目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。由于很多研究的TF不具有结合的特异性，所以即使发现TF和被研究的寡核苷酸探针结合，也不表示在体内该TF不能和其它寡核苷酸结合，运用一些生物信息学软件，可以模拟表示TF与基因启动子区寡核苷酸结合的具体情况，发现TF可以和启动子区PUTATIVE结合。同时，由于EMSA在体外不能模拟细胞内众多生物分子的相互作用，比如，某一TF在细胞内由于受到其它TF的协同或者修饰后才能与寡核苷酸结合的话，那么在体外是不能重现这一结果的。2003年上一篇关于ChIP方法的介绍文献攻击EMSA没有考虑细胞内完整自然的染色质结构和调节的影响而受到很大的限制！下面是在一个PROTOCAL1.探针的标记：(1)如下设置探针标记的反应体系：待标记探针(1.75pmol/微升)2微升T4PolynucleotideKinaseBuffer(10X)1微升Nuclease-FreeWater5微升[γ-32P]ATP(3,000Ci/mmolat10mCi/ml)1微升T4PolynucleotideKinase(5-10u/微升)1微升总体积10微升按照上述反应体系依次加入各种试剂，加入同位素后，Vortex混匀，再加入T4PolynucleotideKinase，混匀。(2)使用水浴或PCR仪，37℃反应10分钟。(3)加入1微升探针标记终止液，混匀，终止探针标记反应。(4)再加入89微升TE，混匀。此时可以取少量探针用于检测标记的效率。通常标记的效率在30％以上，即总放射性的30%以上标记到了探针上。为实验简便起见，通常不必测定探针的标记效率。(5)标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在-20℃。2.探针的纯化：通常为实验简便起见，可以不必纯化标记好的探针。在有些时候，纯化后的探针会改善EMSA的电泳结果。如需纯化，可以按照如下步骤操作：(1)对于100微升标记好的探针，加入1/4体积即25微升的5M醋酸铵，再加入2体积即200微升的无水乙醇，混匀。(2)在-70℃至-80℃沉淀1小时，或在-20℃沉淀过夜。(3)在4℃，12,000g-16,000g离心30分钟。小心去除上清，切不可触及沉。(4)在4℃，12,000g-16,000g离心1分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀，但不宜过分干燥。(5)加入100微升TE，完全溶解沉淀。标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在-20℃。3.EMSA胶的配制：(1)准备好倒胶的模具。可以使用常规的灌制蛋白电泳胶的模具，或其它适当的模具。最好选择可以灌制较薄胶的模具，以便于干胶等后续操作。为得到更好的结果，可以选择可灌制较大EMSA胶的模具。(2)按照如下配方配制20毫升4％的聚丙烯酰胺凝胶(注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis对结果影响不大)。TBEbuffer(10X)1毫升重蒸水16.2毫升39:1acrylamide/bisacrylamide(40%,w/v)2毫升80%甘油625微升10%过硫酸铵(ammoniumpersulfate)150微升TEMED10微升(3)按照上述次序加入各个溶液，加入TEMED前先混匀，加入TEMED后立即混匀，并马上加入到制胶的模具中。避免产生气泡，并加上梳齿。如果发现非常容易形成气泡，可以把一块制胶的玻璃板进行硅烷化处理。4.EMSA结合反应：(1)如下设置EMSA结合反应(预期的结果参见图1)：阴性对照反应：Nuclease-FreeWater7微升EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X)2微升细胞核蛋白或纯化的转录因子0微升标记好的探针1微升总体积10微升样品反应：Nuclease-FreeWater5微升EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X)2微升细胞核蛋白或纯化的转录因子2微升标记好的探针1微升总体积10微升探针冷竞争反应：Nuclease-FreeWater4微升EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X)2微升细胞核蛋白或纯化的转录因子2微升未标记的探针1微升标记好的探针1微升总体积10微升突变探针的冷竞争反应：Nuclease-FreeWater4微升EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X)2微升细胞核蛋白或纯化的转录因子2微升未标记的突变探针1微升标记好的探针1微升总体积10微升Super-shift反应：Nuclease-FreeWater4微升EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X)2微升细胞核蛋白或纯化的转录因子2微升目的蛋白特异抗体1微升标记好的探针1微升总体积10微升(2)按照上述顺序依次加入各种试剂，在加入标记好的探针前先混匀，并且室温(20-25℃)放置10分钟，从而消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合，或者让冷探针优先反应。然后加入标记好的探针，混匀，室温(20-25℃)放置20分钟。(3)加入1微升EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色，10X)，混匀后立即上样。注意：有些时候溴酚蓝会影响蛋白和DNA的结合，建议尽量使用无色的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液。如果对于使用无色上样缓冲液在上样时感觉到无法上样，可以在无色上样缓冲液里面添加极少量的蓝色的上样缓冲液，至能观察到蓝颜色即可。5.电泳分析：(1)用0.5XTBE作为电泳液。按照10V/厘米的电压预电泳10分钟。预电泳的时候如果有空余的上样孔，可以加入少量稀释好的1X的EMSA上样缓冲液(蓝色)，以观察电压是否正常进行。(2)把混合了上样缓冲液的样品加入到上样孔内。在多余的某个上样孔内加入10微升稀释好的1X的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(蓝色)，用于观察电泳进行的情况。(3)按照10V/厘米的电压电泳。确保胶的温度不超过30℃，如果温度升高，需要适当降低电压。电泳至EMSA/Gel-Shift上样缓冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘1/4处，停止电泳。(4)剪一片大小和EMSA胶大小相近或略大的比较厚实的滤纸。小心取下夹有EMSA胶的胶板，用吸水纸或普通草纸大致擦干胶板边缘的电压液。小心打开两块胶板中的上面一块(注：通常选择先移走硅烷化的那块玻璃板)，把滤纸从EMSA胶的一侧逐渐覆盖住整个EMSA胶，轻轻把滤纸和胶压紧。滤纸被胶微微浸湿后(大约不足1分钟)，轻轻揭起滤纸，这时EMSA胶会被滤纸一起揭起来。把滤纸侧向下，放平，在EMSA胶的上面覆盖一层保鲜膜，确保保鲜膜和胶之间没有气泡。(5)干胶仪器上干燥EMSA胶。然后用X光片压片检测，或用其它适当仪器设备检测。EMSA的典型分析结果可以参见下图说明:阴性对照反应(标记探针)；2,常规反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针)；3,探针冷竞争反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针＋标记探针100倍量的未标记探针)；4,突变探针的冷竞争反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针＋标记探针100倍量的未标记突变探针)；5,Super-shift反应(含激活的目的转录因子的核蛋白＋标记探针＋目的转录因子的特异抗体)。生物体内DNA转录成RNA是基因表达的关键过程，基因表达调控主要发生在转录水平。近年来，基因分子生物学研究领域的趋势之一是逐渐从基因结构和功能分析转到基因顺式作用元件和转录因子及其转录调控机理上，对基因转录调控的研究将是今后相当长一段时期内功能基因组学研究的热点之一。在转录水平，基因的转录行为是由顺式作用元件（cis-actingelements）和反式作用因子（trans-actingfactors）（即转录因子）相互作用调控的，因此要探讨基因的表达调控规律，分离、鉴定基因的位点控制区（locicontrolregion，LCR）中顺式作用元件和相应转录因子至关重要。但仅仅如此还不够，对于基因表达调控，必须从三个层次展开：一是分离和鉴定基因5＇端核心启动子等顺式作用元件，二是分离和鉴定与各顺式作用元件相对应的转录因子，三是检测各顺式作用元件与对应转录因子的相互作用。鉴定顺式调控元件和转录因子是研究得比较多的内容，而对于顺式作用元件与对应转录因子的相互作用这个层次的研究相对较为薄弱。电泳迁移率检测（ElectrophoreticMobilityShiftAssay,EMSA）是一种检测蛋白质和DNA序列相互结合的技术，它正是对第三个层次进行研究的技术之一，核心功能是验证蛋白质与特定核酸序列的结合特性，从而间接推断已知蛋白质的靶序列或已知序列的结合蛋白分子。我们知道，结构基因组学已经很容易实现高通量分析，但在功能研究这个层次上，目前还没有真正高通量的分析技术出现。技术的缺乏是后基因组学时代功能研究的主要瓶颈。和其他功能研究技术一样，电泳迁移率检测（ElectrophoreticMobilityShiftAssay,EMSA）本身也存在诸多缺点，比如对于低亲和力结合很难进行鉴定；难以比较不同片断之间亲和力大小的差异；对于蛋白复合体与DNA的结合也无法鉴定。由于体外环境和体内环境存在巨大的差异，电泳迁移率检测（ElectrophoreticMobilityShiftAssay,EMSA）很难真正重建体内蛋白质与DNA之间结合过程。对EMSA进行改良或发展更好的研究蛋白质与DNA互作的技术很有必要。