酶的提取和分离纯化

11酶的提取与分离纯化暨南大学食品科学与工程系包惠燕[e-mail]食品酶学-包惠燕-11思考题1.酶提取纯化过程中应注意些什么？2.酶提取前进行的预处理包括什么？3.酶提取过程中为什么要破细胞？破细胞的方法有哪些？其中哪些可用于大规模生产？4.酶的抽提剂中常见成分的作用？5.酶和其它蛋白质的分离常依据哪些性质差异？分别有哪些主要的分离方法？6.SDS-PAGE指什么？试述其原理和应用。7.试述亲和色谱原理，画出示意图。本章主要内容酶的提取、纯化的基本原则细胞破碎酶的抽提浓缩与初步提纯酶的分离纯化方法酶的纯化步骤酶纯化步骤的定量评价酶的提纯标准及剂型11.酶的提取、分离纯化酶的提取、分离纯化是将酶从细胞或培养基中取出，再与杂质分开，而获得与使用目的、要求相适应的有一定纯度的酶产品的过程酶的提取包括以下内容：材料的选择及前处理破细胞抽提浓缩与初步提纯11.1酶的提取、纯化的基本原则一、防止变性失效二、可以采用比一般蛋白质分离更多更有效的方法和条件三、提取、纯化的每一步都应进行酶活力的检测采用的方法应兼顾酶的回收和提高酶产品的比活力注意点1.除了少数例外，所有操作都应在低温下条件下进行，尤其在有有机溶剂存在时更应特别小心2.大多数酶在pH4或pH10的情况下不稳定，故必须控制整个系统不要过酸或过碱；同时要避免在调节pH时产生局部酸碱过量的现象。3.酶和其它蛋白质一样，常易在溶液表面或界面处形成薄膜而变性，故操作中应尽量减少泡沫形成。4.重金属、有机溶剂等能使酶变性失效，微生物污染、蛋白水解酶的存在能使酶分解破坏，所有这些也都应予以足够的重视。酶分离纯化的工艺流程设计设计时需要考虑的因素：酶源材料前期工艺过程产品对纯度的要求酶存在的状态设备条件动力、原料成本及工时费用酶分离纯化的工艺流程设计合理的工艺应以降低成本，提高效能，同时又提高产品纯度和质量为前提。对一个方法好坏的评价标准是：1.酶的回收率2.酶产品的比活力材料选择及其前处理动物材料：事先剔除结缔组织、脂肪组织植物材料：果实种子事先去皮壳，油质种子用乙醚等脱脂微生物发酵物：先将菌体和发酵物分离胞外酶酶胞内酶结酶溶酶11.2细胞破碎除了动植物体液中的酶和微生物胞外酶之外，大多数酶都存在于细胞内，因此提取和分离纯化前须将进行细胞的破碎。破碎细胞的方法有:机械法，物理法，化学法和酶法11.2.1机械破碎法指通过机械运动所产生的剪切力使细胞破碎的方法，常用的有如下几种：1.机械捣碎法利用捣碎机的高速旋转叶片所产生的剪切力将组织细胞破碎。10000r/min此法在实验室和生产规模均可采用。2.研磨法利用研钵、石磨、球磨(不锈钢或玻璃珠直径0.2-1.0mm)、细菌磨等研磨器械所产生的剪切力将组织细胞破碎，必要时可加入精制石英砂、玻璃粉、氧化铝等作为助磨剂。此法效率较低机械破碎法3.匀浆法利用匀浆器所产生的剪切力将组织细胞破碎。匀浆器一般由硬质磨砂玻璃制成，也可由硬质塑料可不锈钢等制成。通常用来破碎那些易于分散，比较柔软，颗粒细小的组织细胞。此法细胞破碎程度较高，对酶的破坏也较少，但难于在工业生产上应用。11.2.2物理破碎法通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法，统称为物理破碎法。此法多用于微生物细胞的破碎1.温度差破碎法通过温度的突然变化使细胞破碎。例如将冷冻的细胞突然放进较高温度的水中，或将较高温度中的细胞突然冷冻都可使细胞破坏。此法对较脆弱的细胞效果较好。但难以应用于工业化生产。2.压力差破碎法通过压力的变化使细胞破碎。常用的有高压冲击、突然降压和渗透压差法等。（1）高压冲击法是在结实的容器中装入菌体细胞和冰晶、石英砂等混合物，用活塞或冲击锤加高压冲击之，使细胞破碎。冲击压力可达每平方厘米几百至几千kg。Manton-Gaulinhomogeniservalve压力差破碎法（2）突然降压法是将菌体装进高压容器中，加压至30MPa以上，打开出口阀，使菌体悬浮液经阀门流出，出口处压力突然降为常压，由于膨胀而使细胞破碎。突然降压法的另一种形式为爆破性减压法是将菌体悬浮在高压容器中，用氮气或二氧化碳加压到几十至几百大气压，振荡几分钟，使气体扩散到细胞内，然后突然排出气体，压力骤降，使细胞破碎。压力差破碎法（3）渗透压差法是利用渗透压的变化而使细胞破碎。应用时先将对数生长期的细胞从培养液中分离出来，再悬浮在20%左右的蔗糖溶液中平衡一段时间，然后离心收集细胞，迅速投入4℃左右的蒸馏水或低渗溶液中。由于细胞外渗透压突然降低，而使细胞破碎，将细胞中的酶等物质释出胞外。此法适用于膜结合的酶、细胞间质酶等的提取。可用于从海洋微生物中提取某些酶。但对G+菌不适用。3.超声波破碎法利用超声波的机械振动而使细胞膜上所受张力不均而破碎。Fig.Sonicator11.2.3化学破碎法这是应用各种化学试剂与细胞膜作用，使细胞膜的结构发生改变或破坏的方法。常用的试剂可分为有机溶剂和表面活性剂两大类。（1）有机溶剂处理有机溶剂可使细胞膜的磷脂结构破坏，从而改变细胞膜的透过性，再经提取可使膜结合酶或胞内酶等释出胞外。常用的有机溶剂：甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等。（2）表面活性剂处理表面活性剂可以和细胞膜中的磷脂及脂蛋白相互作用，使细胞结构破坏，增加膜的透过性。在酶的提取方面一般采用非离子型的Triton、Tween等表面活性剂。表面活性剂处理对膜结合酶的提取特别有效，在实验室和生产中均已成功使用。11.2.4酶学破碎法在一定条件下，通过外加的酶或细胞本身存在的酶的作用，使细胞破碎。1.外加酶处理根据细胞外层结构特点，选用适当的酶，使细胞壁破坏，并在低渗透压的溶液中使细胞破裂。如溶菌酶能专一作用于肽多糖的β-1，4-糖苷键，常用于G+菌的细胞破碎。β-葡聚糖酶用于酵母细胞的破碎。几丁质酶用于霉菌的细胞破碎纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶往往混合使用，作用于植物细胞的细胞壁。2.自溶法将细胞在一定的pH值和适宜的温度条件下保温一段时间，通过细胞本身存在的酶系将细胞破坏，使胞内物质释出的方法称为自溶法。必要进可加入甲苯、氯仿、叠氮钠等杀菌剂此外可通过加入噬菌体去感染细胞，或通过电离辐射等方法，使细胞自溶。丙酮干粉的制备破细胞等处理后可将材料制成丙酮干粉(acetonepowder)，一般程序是：先将材料粉碎、分散，然后在0℃以下的低温条件下，加入5~10倍预先冷至约-20℃的丙酮，迅速搅拌均匀，随即过滤，最后低温干燥，研磨过筛。丙酮处理一方面能有效地破坏细胞壁，另一方面有利于除去大量的脂类杂质，同时还能使某些膜结合酶易于溶解。此外，丙酮干粉含水量低，便于保存。11.3酶的抽提（萃取、提取）酶的抽提是指在一定条件下，用适当的溶剂处理含酶原料，使酶充分溶解到溶剂中的过程。抽提的要求是将尽可能多的酶，尽量少的杂质从原料引入溶液。酶抽提时首先应根据酶的性质和溶解性质，选择适当的抽提液。抽提液的具体组成和抽提条件取决于酶的溶解性、稳定性以及有利于切断酶和其他物质的联系。抽提剂由于大多数酶属于球蛋白类，一般都溶于稀盐、稀酸或稀碱溶液。但抽提液的具体组成和抽提条件的选择取决于酶的溶解性、稳定性以及如何最有利于切断酶和其他物质的联系。抽提剂的组成破碎生物组织一般在适当的缓冲液中进行，典型的抽提剂由以下几部分组成：离子强度调节剂（如KCl,NaCl,蔗糖）最普通的有0.020~0.050mol/L的磷酸缓冲液，0.15mol/L的NaCl溶液等。pH缓冲剂通常以选用pH4~6为佳温度效应剂(如甘油，二甲亚砜)蛋白酶抑制剂（如PMSF苯甲磺酰氯，DIFP二异丙基氟磷酸）防氧化剂(如巯基乙醇）重金属络合剂（如EDTA，柠檬酸）增溶剂（如TritonX-100,去氧胆酸盐）11.4浓缩与初步提纯1.浓缩抽提液和发酵液中的酶的浓度一般都很低，所以在纯化前往往须先加以浓缩。沉淀法可浓缩并去除部分杂质，此外，浓缩的方法有（1）蒸发法（2）反复冻融法（3）胶过滤（4）超滤法2.初步提纯除去大分子的核酸和粘多糖（1）加硫酸链霉素、聚乙烯亚胺、鱼精蛋白或MnCl2可使核酸沉淀移去。必要时使用核酸酶。（2）常用醋酸铅、乙醇、单宁和离子型表面活性剂等处理解决，有时也用酶。经过初步提纯，余下来的大分子为酶与杂蛋白，分离纯化的主要工作，同时也是比较困难的工作，就是将酶从杂蛋白中分离出来。11.5酶的分离纯化方法现有的酶的分离纯化方法都是根据酶和杂蛋白在下列性质上的差异建立的。性质方法分子大小离心，超离心法、凝胶过滤，膜分离技术（超滤，反渗透，微孔过滤，透析，电渗析等）溶解度盐析法，有机溶剂沉淀法，共沉淀法，选择性沉淀法，结晶电荷或基团离子交换色谱，电泳，等电聚焦，吸附色谱，疏水色谱，聚焦色谱稳定性选择性变性法（热，酸碱，表面活性剂）特殊（专一性结合）亲和色谱，亲和洗脱，亲和电泳酶的分离纯化方法根据溶解度不同进行的纯化按分子大小进行的纯化根据电学解离性质不同进行的纯化利用专一亲和作用进行的纯化根据稳定性差别建立的纯化方法11.5.1根据溶解度不同进行的纯化盐析法有机溶剂沉淀法共沉淀法选择性沉淀法等电点沉淀法液液分离法一、盐析法盐析法是最古老的，但也是目前仍广泛采用的方法。盐析法根据的原理是：球蛋白在低盐浓度的溶液中，溶解度随盐离子强度升高而增大，表现“盐溶(saltingin)”的特性。但是当盐浓度继续升高，并超过某一上限时，其溶解度又会先后以不同速度下降，分别“盐析(saltingout)沉淀析出。盐析纯化法就是根据酶和杂蛋白在高盐浓度的溶液中溶解度差别差别而建立的一种纯化方法。球蛋白溶解度-溶液离子强度关系盐析中性盐类使蛋白质发生沉淀的原因：1).中和蛋白质分子表面电荷2).与蛋白质颗粒竞争水分子不同蛋白质表面极性基团、带电数目及分布等不同，因而可以分级沉淀。盐析法应控制pH使接近等纯化酶的等电点。蛋白质浓度在1mg/ml以上，低温。此法优点：简便，安全，重现性好缺点：分辨率低，纯度提高不显著，同时为了下一步纯化，有时还需要脱盐。盐析盐析法的一个发展就是和色谱技术相结合形成盐析色谱法(saltingoutchromatography)，即以琼脂糖等非极性物质为柱色谱的支持体，在高浓度条件下将样品中的蛋白质盐析吸附，然后再梯度地降低盐类浓度，使酶和杂蛋白分别洗脱出来。这种技术的优点是纯化量大，重复性好，分辨率高较。盐析蛋白质和酶在溶液中的溶解度，与溶液中的离子强度有关：Log(S/S0)=-KsILogS=LogS0-KsI=-KsIS----------蛋白质或酶在离子强度为I时的溶解度（w/v)S0--------蛋白质或酶在离子强度为0时的溶解度Ks--------盐析常数I----------离子强度盐析在一定的温度和pH条件下（为常数），通过改变离子强度的方法可使不同的蛋白质或酶分离，称为KS分段盐析。在一定的盐和离子强度条件下（Ks、I为常数），通过改变温度或pH值使不同物质分离，称分段盐析。二、有机溶剂沉淀法有机溶剂能降低溶液的介电常数，增加蛋白质分子间的静电引力，导致蛋白质的溶解度下降；也可与水作用使蛋白质脱水而趋于凝集、沉淀。利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中溶解度差异而分离的方法称有机溶剂沉淀法。应考虑：温度pH离子和离子强度有机溶剂此法优点：分辨率高，溶剂易除去。缺点：温度控制不当时易引起变性。有机溶剂沉淀法用于蛋白质纯化的有机溶剂中，丙酮的分离效果最好，引起失效的情况比较少。除丙酮外，乙醇和甲醇等也常用。有机溶剂浓度通常以百分体积表示，加入量可按下式计算：V=Vo*(S2-S1)/(S-S2)V－应加入的有机溶剂体积Vo－原溶液的体积S2－所要达到的有机溶剂百分浓度S1－原溶液中有机溶剂的百分浓度S