实验六-植物种子生命力的快速测定2

实验六植物种子生命力的快速测定TTC法红墨水法BTB法种子生活力：是指种子能够萌发的潜在能力或种胚具有的生命力。没有生活力的种子是死亡的种子，不能萌发。种子寿命：种子从发育成熟到丧失生活力所经历的时间。种子寿命既与植物种类有关，也与贮藏条件（种子含水量、贮藏温度）有关。正常性种子：水稻、玉米、小麦等种子（1-3年）短寿命：柳树种子（12h）长寿命：莲子（400年）贮存条件：低温、低湿，保存时间长种子活力检测评估方法：(1)还原力：呼吸→NADH→还原TTC，胚呈红色。(2)原生质着色：活种子不易着色，原生质膜具有选择透性。(3)呼吸释放CO2，pH下降，酸碱指示剂显色。(4)细胞中的荧光物质：紫外照射发蓝、蓝紫色荧光。(5)外观目测法：用肉眼观察玉米种胚形状和色泽。凡种胚凸出或皱缩、显黑暗无光泽的，则种子新鲜，生活力强，可作生产用种。（6）浸种催芽法先将100粒种子用水浸约两小时吸胀，放于湿润草纸上，盖以湿润草纸，置于氧气充足，室温10-20℃环境中，让种子充分发芽；再以发芽的种子粒数除以100，乘以100%，求得发芽率。这种测定方法虽然准确，但需要8天时间。1.实验目的掌握快速测定植物种子生命力的方法理解TTC/BTB/染料法测定种子活力的原理TTC法红墨水法BTB法2.实验原理2.1TTC法TTC（2,3,5-三苯基氯化四氮唑）的氧化态是无色的，可被氢还原成不溶性的红色三苯甲腙（TTF）。当TTC溶液渗入种胚的活细胞内，并作为氢受体被脱氢辅酶（NADH或NADPH）还原时，可产生红色的三苯甲腙（TTF），胚染成红色。如果种胚死亡则不能染色，种胚生命力衰退或部分丧失生活力则染色较浅或局部被染色。因此，可以根据种胚染色的部位或染色的深浅程度来鉴定种子的生命力。TTC还原反应：2,3,5-三苯基氯化四氮唑三苯甲腙TTC法测定主要作物种子生活力要点作物种子准备TTC浓度(%)在35℃下染色时间(h)水稻去壳纵切0.12～3高粱、玉米及麦类作物纵切0.10.5～1棉花、荞麦、蓖麻剥去种皮1.02～3花生、甜菜、大麻、向日葵剥去种皮0.13～4大豆、菜豆、亚麻、二叶草无须准备1.03～42.2染料（红墨水）染色法有生命力种子胚细胞的原生质膜具有半透性，有选择吸收外界物质的能力，一般染料不能进入细胞内，胚部不染色。而丧失生命力的种子，其胚部细胞原生质膜丧失了选择吸收能力，染料可以自由进入细胞内，使胚部染色。因此，可以根据种子胚部是否被染色来判断种子的生命力。2.3BTB（溴麝香草酚蓝）法活细胞呼吸释放CO2，CO2溶于水成H2CO3解离，使种胚周围环境酸度增加，用BTB来反映酸度的改变。BTB变色范围为pH6.0~7.6，酸性呈黄色，碱性呈蓝色，中间经过绿色（变色点为pH7.1）。本实验观察种胚周围的黄色晕圈。材料：小麦种子仪器设备：小烧杯；刀片；镊子；温箱试剂：0.12％～0.5％TTC溶液（TTC可直接溶于水，溶于水后，呈中性，pH7±0.5，不宜久藏，应随用随配）。0.02％～0.2％靛红溶液或5％红墨水（酸性大红G）。3.材料、仪器设备与试剂4.实验步骤1）将种子用温水（约30℃）浸泡2~6h，使种子充分吸胀。2）随机取小麦种子30粒，沿种胚中央准确切开，每切1粒确认各半种子皆含胚后，分别放置两只培养皿中。3）在上述一只培养皿中加入TTC溶液（至其中种子全部浸入为止），恒温箱（30~35℃）中保温至少30min。从TTC溶液中取出种子，直接观察种胚颜色变化。4）在上述另一培养皿中加入约5ml红墨水，室温下浸5min；倒出红墨水后，用清水冲洗种子1~2次（注意要缓慢冲洗，不要让水流直接冲到种子上），观察种胚被染色的情况。TTC/红墨水法TTC法：凡种胚全部或大部分被染成红色的即为具有生命力的种子；种胚不被染色的为死种子。红墨水法：凡胚部不着色或表面略带浅红色者，即具有生活力的种子；若胚部染成与胚乳相同的红色，则为死种子。鉴定标准BTB法1）煮沸的1％BTB琼脂胶约20ml，倒胶至培养皿（1/3皿），冷却。2）取30粒完好的小麦种子，种胚向下略斜插入胶（不软不硬）。3）将培养皿置于35℃下培养1h，对光观察，如果种胚附近呈现较深黄色晕圈是活种子，否则是死种子。TTC/红墨水法：1）将种子用温水（约30℃）浸泡2~6h，使种子充分吸胀。2）随机取小麦种子30粒，沿种胚中央准确切开，每切1粒确认各半种子皆含胚后，分别放置两只培养皿中。3）在上述一只培养皿中加入TTC溶液（至其中种子全部浸入为止），恒温箱（30~35℃）中保温至少30min。从TTC溶液中取出种子，直接观察种胚颜色变化。4）另一培养皿中加入约5ml红墨水，室温下浸5min；倒出红墨水后，用清水冲洗种子1~2次（注意要缓慢冲洗，不要让水流直接冲到种子上），观察种胚被染色的情况。BTB法：1）煮沸的1％BTB琼脂胶约20ml，倒胶至培养皿（1/3皿），冷却。2）取30粒完好的小麦种子，种胚向下略斜插入胶(不软不硬)。3）将培养皿置于35℃下培养1h，对光观察，如果种胚附近呈现较深黄色晕圈是活种子，否则是死种子。实验步骤不同方法测定种子生活力记录表方法供试粒数有生活力种子粒数无生活力种子粒数有生活力种子占供试粒数的%TTC30红墨水30BTB305.结果与分析分析TTC法和红墨水法测定的种子生活力结果，比较三种方法快速检测种子活力的优缺点。6.注意事项1）TTC溶液最好现配现用，如需贮藏则应贮于棕色瓶中，放在阴凉黑暗处，如溶液变红则不可再用。2）TTC反应温度一般以30~35℃为宜。3）TTC反应结束，从黑暗下取出后立即观察，因光下久放TTC本身会变色。4）显色时要使漂浮的种子全部浸入试剂中。TTC法：1）染料浸泡时要使漂浮的种子全部浸入试剂中；2）染色时间不能太长，否则不易区分。染料染色法：1）BTB溶胶层厚度取决于种子大小，原则上保证种胚接触皿底后尚有部分露出胶层上方，胶层厚度可使种子稳定在其中；2）取完好小麦种子，将种胚轻稳地向下插入BTB琼脂胶中。BTB法：7.思考题TTC法和红墨水法测定种子生活力的理论依据有何不同?