X-tremeGENE-HP-DNA-Transfection-Reagent中文说明书

仅供生命科学研究使用。不可用于诊断程序。X-tremeGENEHPDNATransfectionReagent用于真核细胞的瞬时及稳定转染货号：063662440010.4ml货号：063662360011ml货号：063665460015x1ml保存温度：-15至-25℃1.产品用途实验次数按照标准程序，1mlX-tremeGENEHPDNATransfectionReagent用于96孔板的转染反应，最多达10,000个孔的反应。试剂成分X-tremeGENEHPDNATransfectionReagent是一种脂质与其他组份构成的混合物，溶于80%的乙醇中，经0.2μm膜过滤，装载于玻璃瓶中。不含任何人源或动物来源组份。保存与稳定性X-tremeGENEHPDNATransfectionReagent于–15至–25°C条件下，密闭保存。下列条件保存情况下，试剂可保持稳定性达标签注明的失效日期。试剂使用完毕后拧紧瓶盖并保存于-15至-25℃，即使反复开启试剂瓶（如两个月间至少反复开启5次），X-tremeGENEHPDNATransfectionReagent依然保持全部的性能。注意，此产品运输温度与保存温度不同。不同的运输温度不会影响产品性能或产品稳定性。操作注意事项取出所需用量后，立即重新盖紧试剂瓶。取用X-tremeGENEHPDNATransfectionReagent前，将试剂瓶放置于+15至+25℃平衡，漩涡混匀1s混合均匀。请勿分装X-tremeGENEHPDNATransfectionReagent，将试剂保存于原始玻璃瓶中。尽量避免将未稀释的X-tremeGENEHPDNATransfectionReagent与塑料表面接触。每次转染实验中制备的X-tremeGENEHPDNATransfectionReagent：DNA复合物的最小体积是100μl。减少复合物制备体系的体积将显著降低转染效率。请勿使用聚苯乙烯材质的试管或微板进行X-tremeGENEHPDNATransfectionReagent：DNA复合物制备。如无法避免使用聚苯乙烯材料时，确保吸取转染试剂后直接加至无血清培养基中（例如：Opti-Mem）。请勿使用硅化吸头或试管。所需的其他设备与试剂使用X-tremeGENEHPDNATransfectionReagent进行转染所需的其他试剂与设备包括：标准实验室设备-标准细胞培养设备（例如：生物安全柜、培养箱）-标准移液器与微量移液器-涡旋混匀器质粒制备-纯化质粒储液（0.1-2.0μg/μl），溶于无菌TE（10mMTris,1mMEDTA，pH值8.0）缓冲液或无菌水中-使用GenopurePlasmidMidiKit*或GenopurePlasmidMaxiKit*进行质粒制备载体的转染验证功能-选择转染后可进行验证分析的合适载体-使用G-418Solution*或HygromycinB*（稳定转染实验可选）转染复合物形成-Opti-MEMIReducedSerumMedium或无血清培养基-无菌聚丙烯材质试管或96孔板培养细胞-选择对数期的近汇合的培养物进行细胞转染实验-对细胞数量进行定量，使用数量相同的细胞进行实验以提高实验重复性应用X-tremeGENEHPDNATransfectionReagent是一种高性能转染试剂，不含动物来源组份。X-tremeGENEHPDNATransfectionReagent的特性如下：该试剂被设计用于广泛细胞系的转染，包括昆虫细胞，使用其他方法转染低效的细胞系，以及难以转染的细胞系（例如：HT-1080、K-562、HepG2）。成功用于多种应用研究，如通过瞬时转染实验进行基因表达分析和蛋白质表达、构建稳定细胞系、基因敲除研究的shRNA表达、药物开发项目，以及靶向评价。更多转染相关的技术信息请见在获得高效转染的同时，最小化细胞毒性及细胞形态学的改变，转染复合物添加后，不需要更换培养基。适合用于瞬时及稳定转染。有无血清情况下，性能均极佳。版本05目录版本：2011年5月2.如何使用本产品2.1实验开始前X-tremeGENEHPDNATransfectionReagent试剂用量转染时单层细胞汇合度应在70-90%，为进行反应条件优化，进行X-tremeGENEHPDNATransfectionReagent（μl）与DNA（μg）比值为1:1、2:1、3:1与4:1的滴度试验。研究结果显示，对于多种细胞类型，X-tremeGENEHPDNATransfectionReagent（μl）与DNA（μg）比值3：1为最佳。细胞汇合度稍低也可成功转染。在您的特定应用中，可进一步优化操作以提高转染效率。除调整比率外，也可对其他参数进行评价，如添加的转染复合物的量。关于其他优化指南，参见下文“疑难解答”，或访问为获得最佳结果，通过260nm吸光度准确测定质粒DNA浓度，不建议通过凝胶带密度测定进行DNA浓度估测。通过260nm/280nm比值评估质粒样品纯度（最佳比值是1.8）。使用无菌TE（Tris/EDTA）缓冲液或无菌水进行质粒DNA溶液制备，DNA浓度为0.1至2.0μg/μl。使用高质量DNA制备试剂盒进行无内毒素DNA制备。细胞培养条件为最小化实验内及实验间的转染效率差异，使用定期传代、增殖情况良好的处于对数生长期的细胞，始终使用一致的细胞密度进行接种。为获得最佳结果，使用血细胞计数器或自动化细胞计数系统进行准确的细胞浓度定量。细胞必须处于健康状态、不含支原体污染。使用传代数少的细胞以获得最佳结果。其他培养添加物对于某些细胞类型，细胞培养基中通常添加有抗微生物制剂（例如：抗生素与抗真菌制剂），这些添加物会降低X-tremeGENEHPDNATransfectionReagent的转染效率。如可能，在初始实验中去除这些添加物。建立高效转染条件后，可重新进行添加，但同时需监测转染效率。细胞生长与/或转染效率可受到血清质量与培养基组份的影响。载体的转染验证功能使用新载体进行细胞转染时，配合阳性对照报告基因进行转染条件优化：通过报告基因实验如β-Gal*、荧光素酶*，或SEAP*进行转染效率测定。进行载体插入区域的侧翼测序对新构建载体的完整性进行验证。2.2转染用细胞制备贴壁细胞：转染前在合适的容器中接种细胞，培养约24小时，确保细胞处于最佳浓度。悬浮细胞：按照最佳浓度接种新鲜传代细胞。2.3转染操作步骤将X-tremeGENEHPDNATransfectionReagent、DNA与稀释液平衡至+15至+25℃。短暂漩涡混匀X-tremeGENEHPDNATransfectionReagent。使用合适的稀释液（例如无血清培养基）将DNA稀释至终浓度为1μg质粒DNA/100μl培养基（0.01μg/μl）。轻柔混匀。将含有1μgDNA的100μl稀释液分别加至标记有1:1、2:1、3:1与4:1的无菌管中。使用的稀释剂体积应不少于100μl。减少体积会显著降低转染效率。使用无菌管或适用于组织培养的96孔板进行转染复合物制备。将X-tremeGENEHPDNATransfectionReagent（1、2、3或4μl）直接添加至含稀释DNA的培养基中，切勿接触到塑料管壁。轻柔混合。为避免降低转染效率，勿使未稀释的X-tremeGENEHPDNATransfectionReagent接触到塑料表面。勿使用硅化吸头或试管。+15至+25℃下孵育转染试剂:DNA复合物15分钟。某些情况下，如特殊的稀释比率及细胞类型，需要延长孵育时间（最长30分钟）。根据您所用特殊细胞系及所用比率优化孵育时间。从培养箱中取出细胞培养皿。无需弃去生长培养基。将转染复合物逐滴加至细胞中。参见表1，根据您使用的细胞培养容器的表面积，确定复合物滴加体积。轻柔振荡或旋转培养皿或培养瓶，确保培养物均匀分布于培养板表面。对于96孔板，建议使用旋转仪低速旋转30秒混匀。转染试剂：DNA复合物添加至细胞中后，无需更换新鲜培养基（其他转染试剂可能需要更换成新鲜培养基）。转染后，孵育细胞18-72小时后测定蛋白质表达。孵育时间取决于多种因素，包括转染载体类型、转染的细胞类型、细胞培养基、细胞密度与表达的蛋白质类型。孵育后，使用合适的检测方法进行蛋白质表达测定。注意：实验过程中需使用合适的质控品。包括未转染的细胞培养物、仅加入转染试剂的细胞培养物、和仅加入DNA的细胞培养物。对于稳定转染实验来说，直至细胞传代前，不可将含复合物的培养基更换。细胞传代时可添加适当的选择性抗生素（例如：G418溶液或潮霉素B）。参见表1，根据您使用的细胞培养容器的表面积，确定相应复合物滴加体积，和组分用量。为方便实验，在每孔含0.1ml培养基的96孔培养板进行小体积转染试验时，先进行100μl转染复合物的制备，然后于每孔中添加10μl转染复合物进行转染（取决于细胞类型）。转染试剂与DNA的最佳比率，每孔复合物的最佳用量，须根据细胞系、细胞密度、分析时间与所表达的基因进行优化。测试不同比率的复合物进行实验条件优化，于最适比率范围中选择中间值进行后续实验。表1：不同培养容器中X-tremeGENEHPDNATransfectionReagent:DNA复合物的建议用量培养容器表面积（cm2）培养基体积（ml）制备100μl转染复合物，添加至每孔的推荐体积（μl）1:1或4:1比率的DNA用量（μg）1:1比率X-tremeGENEHPDNATransfectionReagent用量（μl）4:1比率X-tremeGENEHPDNATransfectionReagent用量（μl）96孔板（每孔）0.30.1100.10.10.448孔板（每孔）1.00.3300.30.31.224孔板（每孔）1.90.5500.50.5212孔板（每孔）3.8110011435mm培养皿822002286孔板（每孔）9.4220022860mm培养皿215500552010cm培养皿55101000101040T-25培养瓶2566006624T-75培养瓶752020002020802.4疑难解答疑难现象可能原因建议转染效率低非优化的X-tremeGENEHPDNATransfectionReagent:DNA比率进行X-tremeGENEHPDNATransfectionReagent：DNA的比率优化。参考本说明书2.1“实验开始前”。细胞数量不足针对不同的细胞类型确定最佳细胞密度。对于大多数细胞类型来说，转染时70-90%的汇合度为最佳。X-tremeGENEHPDNATransfectionReagent:DNA复合物形成不佳在无血清培养基中制备复合物（例如：Opti-MEM）。勿使用硅化吸头或试管。勿分装X-tremeGENEHPDNATransfectionReagent。转染孵育时间确定最佳孵育时间（18-72小时）。对大多数细胞类型和质粒来说，最佳孵育时间是24-48小时。培养基组份的抑制作用某些培养基组份（例如聚阴离子）可能会降低转染效率。X-tremeGENEHPDNATransfectionReagent：DNA复合物用量低X-tremeGENEHPDNATransfectionReagent：DNA复合物的体积应不小于100μl。复合物形成体系减小可显著降低转染效率。细胞毒性高细胞密度不佳应进行所有细胞类型最佳细胞密度测定。对于大多数细胞类型来说，推荐转染汇合度为70-90%，不同的汇合度可能会提高细胞活性。细胞在无血清培养基中培养使用X-tremeGENEHPDNATransfectionReagent可进行无血清培养基细胞培养物的转染，但无血清情况下，毒性更大。X-tremeGENEHPDNATransfe