叶盘法转基因

烟草转基因实验一．实验目的：学习并了解叶盘法转基因烟草的技术流程。二.实验原理：壤中的农杆菌是一种革兰氏阴性菌，能够感染植物的受伤部位。农杆菌中有一种环形的Ti质粒，Ti质粒最重要的两个区域为T-DNA区和毒性区，T-DNA是Ti质粒上唯一能够整合到植物染色体上的序列，而毒性区上一系列则帮助T-DNA区整合到植物的染色体上。/P,Tv%sf*}2B+G:L;E.[土壤农杆菌转化植物的常用方法是叶盘法。这种转基因方法十分简单，一般是将植物的叶片切成小圆片，用农杆菌感染后共培养2-4天，而后转移到加有选择压的分化培养基上分化出芽，在MS培养基上生根后，再生出完整的植株。三.试剂及设备1.试剂：MS培养基：配方见“植物的组织培养技术”实验指导Kan：卡那霉素Cb：羧苄青霉素NAA：萘乙酸6-BA：细胞分裂素T1培养基：MS培养基T2培养基：MS培养基6-BA2.0mg/LNAA0.5mg/LKan100mg/LCb500mg/L!T3培养基：MS培养基Kan100mg/LCb500mg/LT2：生长培养基；T3：生根培养基）2.仪器：照培养箱，恒温摇床，超净工作台，接种器械等四.实验步骤：1农杆菌培养从平板上挑取含有目的基因的单菌落，接种到3mlYEB液体培养基中（Str25μg/ml、Rif50μg/ml、Kan80μg/ml）于恒温摇床上27℃，180rpm摇培过夜至OD600为0.6-0.8。2摇培过夜的菌液按1%-2%的比例，转入新配置的无抗生素的YEB培养基中，在与上述相同的条件下培养6h左右，OD600为0.2-0.5时即可用于转化。或：将按上述方法培养的OD600为0.6-0.8的菌液，转入无菌离心管中，于室温条件下，5000rpm离心10min，去掉上清液，菌体用1/2MS液体（pH5.4-5.8）培养基重悬，稀释至OD600为0.2左右，用于转化。3侵染于超净工作台上，将菌液倒入无菌的小培养皿中。取不具Kan抗性的烟草无菌苗的幼嫩、健壮叶片，去主脉，将叶片剪成0.5cm2的小块，放入菌液中，浸泡适当时间（一般5-10min）。取出叶片置于无菌滤纸上吸去附着的菌液。注：同时设未经农杆菌侵染的叶盘作为阴性对照，以下步骤同。4共培养将侵染后的烟草叶片接种在不含任何激素和抗生素的MS基本培养基（T1）上，用封口膜封好培养皿，28℃黑暗中培养2-4天。5选择培养将黑暗中共培养2-4天的烟草叶片转移到筛选培养基(T2)中，用封口膜封好培养皿，在光照为2,000-10,000lux、25-28℃、16/8hd-1光暗条件下选择培养。注：叶盘边缘轻压入培养基中，以增加选择压力。生根培养约2-3周后，待不定芽长到1cm左右时，切下不定芽并转移到生根培养基(T3)上进行生根培养，5-10天后长出不定根。