toyobo-SYBR

10-08SYBR®GreenRealtimePCRMasterMix(CodeNo.QPK-201,QPK-201T)使用说明书科研用TOYOBOCO.,LTD.LifeScienceDepartmentOSAKAJAPAN目录[1]前言..................................................................................................................................................1[2]本产品的组成...............................................................................................................................2[3]其他必需品....................................................................................................................................3[4]使用方法.........................................................................................................................................4[5]常见问题.........................................................................................................................................8[6]相关产品.......................................................................................................................................10【注意】本产品为科研用试剂。请勿作为诊断、临床试剂使用。此外，对于本产品的有害性调查还不十分全面，因此，在使用时，请严格遵守实验室的一般注意事项，适当使用保护用品，安全操作。本产品是在与F.Hoffmann-LaRocheLtd.、RocheMolecularSystemsInc.及ThePerkin-ElmerCorporation的特许合同约定下销售的。“PurchaseofthisproductisaccompaniedbyalimitedlicensetouseitinthePolymeraseChainReaction(PCR)processforTheResearchFieldinconjunctionwithathermalcyclerwhoseuseintheautomatedperformanceofthePCRprocessiscoveredbytheup-frontlicensefee,eitherbypaymenttoPerkin-Elmeroraspurchased,i.e.,anauthorizedthermalcycler.”※LightCyclerTM是IdahoTechnologyInc.和RocheMolecularSystemsInc.的商标。※TaqMan®是RocheMolecularSystemsInc.的注册商标。※SYBR®是MolecularProbesInc.的注册商标。※ABIPRISM®是ThePerkin-ElmerCorporation的注册商标。[1]前言本产品是在TaqDNApolymerase基础上开发的通用性很高的RealtimePCR用2×浓度的预混液，已包含除引物和样品DNA以外的所有组分。适用于以cDNA、DNA为样品的SYBR®GreenⅠ掺入法检测，可获得重复性良好的结果。◆本产品特征◆1．高通用性本产品适用于各种常见实时定量PCR仪：1）产品中添加了BSA，能够应用于Roche公司的LightCyclerTM以及其它使用GlassCapillary的分析体系；2）产品中还添加了PassiveReference（内含1×浓度ROXreferencedye），可应用于AppliedBiosystems公司的ABIPRISM®实时定量PCR仪。经确认，使用其它仪器的时候，即使不使用PassiveReference，也不会对实验本身造成影响。本说明书仅以AppliedBiosystems公司的ABIPRISM®和Roche公司的LightCyclerTM为例进行说明，供使用者参考。对于其他厂家的实时定量PCR仪，请使用者根据仪器说明书，并结合实际情况进行适当调整。2．快速热启动为了抑制非特异性反应，本产品中添加了抗TaqDNA多聚酶的单克隆抗体进行热启动。此方法的优点是酶活力的释放极快，在1分钟内即可完成预变性。各循环的变性步骤只需考虑核酸变性所需的时间进行设定即可。如果使用LightCyclerTM等高速PCR仪，则更能显示出其缩短时间的优越性。3．操作简便由于采用了2×MasterMix体系，已经把除引物、模板之外的酶、Buffer、dNTP等预混在一起，因而减少了操作步骤，既缩短了加样时间，又降低了污染的几率。关于SYBR®GreenⅠ检测体系SYBR®GreenⅠ检测体系通过SYBR®GreenⅠ染料与DNA的扩增产物结合，并且结合后染料的荧光强度的增强作为指标，进行检测。东洋纺（上海）生物科技有限公司垂询电话：[phone]虽然该方法和普通的PCR反应一样简便，但由于会出现引物二聚体、目的条带以外的扩增产物等，因此有必要在扩增后对融解曲线进行分析确认。[2]本产品的组成本产品分为两个包装，50μl反应体系可用40次份（QPK-201T）和200次份（QPK-201）。QPK-201TSYBR®GreenRealtimePCRMasterMix1mlQPK-201SYBR®GreenRealtimePCRMasterMix1mlx5该组分是包含反应缓冲液、SYBR®GreenⅠ、dNTPs、Mg2+、TaqDNA聚合酶及抗Taq单克隆抗体的2×预混液。请添加模板DNA和引物，并用灭菌蒸馏水配制成1×浓度后再使用。该溶液中已包含1×浓度ROX（Passivereferencedye）。注意本产品原则上在-20℃以下避光冷冻保存。但是，如果在短期内需持续使用时，可于融解后在4℃避光保存，此时最长可保存2个月。保存时请使用避光箱或产品内配有的铝箔袋。5支装的QPK-201包装内另外还添附有一个铝箔袋，建议逐支融解使用。融解后，于4℃状态保存，并尽量在3周内使用完毕。融解后的产品短期内不用时，请装入原包装袋，再次于-20℃状态下进行避光冷冻保存。（本公司经实验确认，反复冻融20次对产品质量没有明显影响。）为保证实验效果，请在收到产品的一年之内使用完毕。[3]其他必需品除本产品外，还需准备以下试剂和仪器。（1）RealtimePCR仪本产品适用于普通及高速的模块型（BlockType）、玻璃毛细管型（GlassCapillaryType）等各种RealtimePCR仪。请使用者根据各仪器说明书，结合实际情况进行适当调整。本书仅以AppliedBiosystems公司的ABIPRISM®和Roche公司的LightCyclerTM为例进行说明，供使用者参考。（2）引物请根据目的基因的序列设计引物对，引物设计对实时定量PCR实验的精确度和重现性非常重要。以下列举了设计引物时需注意的一般事项。-引物长度请设定为20～30mer、GC含量为40～60%。-扩增片段应小于200bp，如可能请尽量设定在50～150bp。过长的片段容易导致扩增效率低下，而且容易导致非特异性反应，影响定量准确性。-引物设计应尽量横跨内含子，以防止基因组DNA的扩增而引起假阳性。（3）模板DNAcDNA1stStrandcDNA合成产物请使用苯酚氯仿处理•乙醇沉淀等方法提纯。1ststrandcDNA合成时的引物，可采用随机引物或者Oligo(dT)n引物，请注意引物用量对于后续PCR反应的影响。如果使用本公司的1stStrandcDNA合成试剂盒「ReverTraAce-α-」(Code:FSK-100)，请稀释10倍以上使用。原液也可以进行扩增，但cDNA合成时的引物或逆转录酶会对PCR产生影响，因此，建议稀释后使用。添加量不应超过总反应体系的10%。过量的添加会大大改变PCR反应缓冲液的组成，导致定量性低下。※本公司的RealtimePCR用逆转录试剂盒ReverTraAceqPCRRTKit（CodeNo.FSQ-101），通过改良组分，使带入到RealtimePCR反应体系的逆转录反应液的影响降到最小，即便在PCR反应体系中添加最多至20%的液量，也能表现出良好的反应曲线。东洋纺（上海）生物科技有限公司垂询电话：[phone]基因组DNA请使用普通PCR用的DNA纯化样品。如果是人类基因组DNA，1～10ng比较适当。如果加入大量基因组DNA，会检测出基因组本身的信号，导致基线上飘。（4）蒸馏水请使用普通PCR用灭菌蒸馏水。[4]使用方法4.1ABIPRISM®7700的SYBR®Green掺入法使用说明(1)反应液的配制试剂添加量终浓度蒸馏水16μlSYBR®GreenRealtimePCRMasterMix25μl1x上游引物(10μM)2μl0.4μM下游引物(10μM)2μl0.4μM样品溶液5μlTotalvolume50μlz将SYBR®GreenRealtimePCRMasterMix设定为反应体系的1/2，其他的组成成份请参照最适条件进行调整。如需改变反应体系的总体积，其他组成成份也应按相同比例改变。z引物的添加量请在终浓度0.2～0.6μM的范围内进行调整。若扩增效果不理想，增加引物的添加量会有所改善，但添加量过多，则可能会由于非特异性扩增的原因，出现信号检出率低的情况。z实际配制时，可先将除样品溶液之外的其他组份预混成n+α倍（n为样品数，α为分注损耗）的混合液，然后分注到各管（即n管），最后在每管中分别加入相应的样品溶液。(2)PCR的循环条件[PCR循环(例1)](三步法，退火温度60℃／延伸温度72℃)95℃60s↓↓融解曲线分析(MeltingCurveAnalysis)[PCR循环(例2)](两步法，退火／延伸温度60℃)95℃60s↓↓融解曲线分析(MeltingCurveAnalysis)z首先请尝试三步法（例1）。退火温度请根据引物的Tm值在55℃-65℃之间进行调整。根据引物的不同，有时最佳温度可能超出此范围，此时请根据实际情况调整。z本产品因可以在极短时间内完成多聚酶的再活性化，所以最初变性时间60秒，各循环变性时间15秒即可达到良好的扩增效果。请注意，绝大多数情况下，最初变性时间1分钟就足够了，过分加热会影响酶的活性，特别要注意避免变性时间超过5分钟。z请将Detector设为SYBR，Quencher设为None。详细设置请参照仪器说明书。z实时定量PCR中目标片段通常都很小，一般不需调整延伸时间，如需变更，请务必确保datacollection步骤在30秒以上。z上述实例的循环设置采用的是三步法。此外也可采用两步法作为PCR的循环条件，此时请将datacollection设置在退火／延伸步骤（即将退火／延伸步骤合