DNA残留检测方法

DNA残留检测方法比较及Threshold特点和优势©2011MolecularDevices,Inc.DevicesproductsareforResearchUseOnly.Notforuseindiagnosticprocedures.MolecularDevices,theMolecularDeviceslogo,andallothertrademarksunlessotherwiseindicatedarethepropertyofMolecularDevices,Inc.主要内容DNA残留检测应用领域及其重要意义常用几种检测方法及其各自优缺点（光吸收、荧光法、杂交法、荧光定量PCR法）Threshold方法的原理和特点竞争分析总结©2011MolecularDevices,Inc.DevicesproductsareforResearchUseOnly.Notforuseindiagnosticprocedures.MolecularDevices,theMolecularDeviceslogo,andallothertrademarksunlessotherwiseindicatedarethepropertyofMolecularDevices,Inc.DNA残留检测主要应用领域及其趋势1：随着生物医药技术发展，越来越多哺乳动物细胞生产治疗性疫苗和治疗性生物制品；2：中国市场目前现状©2011MolecularDevices,Inc.DevicesproductsareforResearchUseOnly.Notforuseindiagnosticprocedures.MolecularDevices,theMolecularDeviceslogo,andallothertrademarksunlessotherwiseindicatedarethepropertyofMolecularDevices,Inc.常见生物制品和对其外源DNA含量要求1：单克隆抗体（注射用抗人T细胞CD3鼠单抗）、重组蛋白质制品、疫苗（药典收录需要检测残留DNA的疫苗包括乙脑、狂犬、出血热、脊髓灰质炎、甲肝疫苗等）2：WHO、EU、FDA及SFDA等对外源DNA残留限量限定不同狂犬疫苗为例：如中国药典对ＤＮＡ残留限定在100pg/每人份剂量、脊髓灰质炎10pg/每人份剂量WHO最新认定不高于10ng均为安全FDA限定为100pg/每人份剂量目前需要：稳定且灵敏度高的检测方法©2011MolecularDevices,Inc.DevicesproductsareforResearchUseOnly.Notforuseindiagnosticprocedures.MolecularDevices,theMolecularDeviceslogo,andallothertrademarksunlessotherwiseindicatedarethepropertyofMolecularDevices,Inc.DNA残留检测重要性为什么要检测？？？细胞（Vero、CHO）培养产生的生物制品含有特定的杂质，会包括宿主细胞蛋白和DNA对人可能产生危害：残留外源DNA可能造成插入突变﹑导致抑癌基因失活﹑癌基因被激活等，最终造成疫苗使用者致癌；证实原代细胞为安全的©2011MolecularDevices,Inc.DevicesproductsareforResearchUseOnly.Notforuseindiagnosticprocedures.MolecularDevices,theMolecularDeviceslogo,andallothertrademarksunlessotherwiseindicatedarethepropertyofMolecularDevices,Inc.光吸收法检测DNA原理：DNA或者RNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收，其吸收峰在260nm处DNA或RNA的浓度OD260=1.0相当于•50µg/ml双链DNA(dsDNA)•40µg/ml单链DNA/RNA•20µg/ml寡核苷酸(Oligos)优点：快速简便缺点：不能区DNA还是RNA、检测灵敏度不高、易受到杂质干扰（蛋白质或者盐类）©2011MolecularDevices,Inc.DevicesproductsareforResearchUseOnly.Notforuseindiagnosticprocedures.MolecularDevices,theMolecularDeviceslogo,andallothertrademarksunlessotherwiseindicatedarethepropertyofMolecularDevices,Inc.荧光法检测DNA（2010版药典收录Picogreen）原理：荧光染料分子直接与双链DNA结合后，经带有荧光功能的酶标仪激发后产生荧光信号•双链DNA(dsDNA)PicoGreen(MolecularProbes)优点（与吸收光比）：特异性较好、具有一定程度耐盐，乙醇和蛋白干扰、检测灵敏度高（2010版中国药典给出数据：可达300pg左右，线性1.25-80ng/mlR0.99，线性范围较好）缺点：要做标曲、荧光信号易受干扰、有些生物制品对DNA检测灵敏度达100pg以下，Picogreen不能达到dsDNApicogreenExEm©2011MolecularDevices,Inc.DevicesproductsareforResearchUseOnly.Notforuseindiagnosticprocedures.MolecularDevices,theMolecularDeviceslogo,andallothertrademarksunlessotherwiseindicatedarethepropertyofMolecularDevices,Inc.荧光法检测DNA（2010版药典收录PicoGreen）重组制品外源ＤＮＡ残留检测要求（中国药典）中检所应用PicoGreen所检测生物制品种类注射用重组人干扰素γ（E.coli）注射用重组人干扰素α1b（E.coli）注射用重组人干扰素α2b(酵母)注射用重组人干扰素α2b（假单胞菌）注射用重组人干扰素α2b（E.coli）注射用重组人干扰素α2a（酵母）\(E.coli)注射用重组链激酶注射用重组人白介素-2（I）（E.coli）重组人干扰素α2a栓重组人干扰素α2b凝胶重组人干扰素α2b喷雾剂(假单胞菌)等等要求不高于10ng©2011MolecularDevices,Inc.DevicesproductsareforResearchUseOnly.Notforuseindiagnosticprocedures.MolecularDevices,theMolecularDeviceslogo,andallothertrademarksunlessotherwiseindicatedarethepropertyofMolecularDevices,Inc.荧光法检测DNA（2010版药典收录PicoGreen）注射用重组人促红素（CHO细胞）重组乙型肝炎疫苗(CHO细胞)要求不高于100pg和10pg（PicoGreen不适用）©2011MolecularDevices,Inc.DevicesproductsareforResearchUseOnly.Notforuseindiagnosticprocedures.MolecularDevices,theMolecularDeviceslogo,andallothertrademarksunlessotherwiseindicatedarethepropertyofMolecularDevices,Inc.杂交法检测DNA原理：基于Southern原理，样品中外源性DNA经变性为单链后吸附于固相膜上，在一定温度下可与相匹配的特异性单链DNA复性而重新结合成为双链ＤＮＡ，称之为杂交；特异性单链DNA（探针）：标记上酶、放射性同位素、地高辛、生物素等地高辛探针优势：操作方便、灵敏度高，稳定性好、无内源性背景等；©2011MolecularDevices,Inc.DevicesproductsareforResearchUseOnly.Notforuseindiagnosticprocedures.MolecularDevices,theMolecularDeviceslogo,andallothertrademarksunlessotherwiseindicatedarethepropertyofMolecularDevices,Inc.地高辛杂交法检测DNA（药典收录）简介:植物中提取-异羟基洋地黄毒苷(Digoxin)类固醇半抗原分子原理（Vero细胞表达的狂犬病疫苗）：标记特异性单链DNA后，与吸附在固相膜（尼龙膜）样品单链DNA杂交，显色并与已知含量阳性DNA对照比对后，得到外源样品中ＤＮＡ含量，理论灵敏度达到10pg左右；不足：需要厂家提供细胞或工程菌、检测样品需要量大、比色法（不能定量）、实验周期长且操作繁琐、干扰因素多、对PH值要求严格等©2011MolecularDevices,Inc.DevicesproductsareforResearchUseOnly.Notforuseindiagnosticprocedures.MolecularDevices,theMolecularDeviceslogo,andallothertrademarksunlessotherwiseindicatedarethepropertyofMolecularDevices,Inc.qPCR法检测DNA原理：实时荧光定量核酸扩增检测系统（Real-timeQuantitativePCRDetectingSystem）SYBRGreenI荧光染料与DNA双链具有高亲和力，结合后荧光强度可增加800-1000倍；在溶液中SYBRGreenI过量时，荧光强度与双链DNA浓度成正比。因此可用于溶液中dsDNA的定量©2011MolecularDevices,Inc.DevicesproductsareforResearchUseOnly.Notforuseindiagnosticprocedures.MolecularDevices,theMolecularDeviceslogo,andallothertrademarksunlessotherwiseindicatedarethepropertyofMolecularDevices,Inc.磁珠法抽提ＤＮＡ©2011MolecularDevices,Inc.DevicesproductsareforResearchUseOnly.Notforuseindiagnosticprocedures.MolecularDevices,theMolecularDeviceslogo,andallothertrademarksunlessotherwiseindicatedarethepropertyofMolecularDevices,Inc.优点：时间短、可定量、特异性强、灵敏度最高、动态学范围宽（3ng-30fg）、减少样品的使用量等不足：只能针对特定宿主细胞DNA检测（CHO、Ecoli、Vero）不能检测总DNA、需设计引物©2011MolecularDevices,Inc.DevicesproductsareforResearchUseOnly.Notforuseindiagnosticprocedures.MolecularDevices,theMolecularDeviceslogo,andallothertrademarksunlessotherwiseindicatedaret