黑曲霉菌丝体真空冷冻干燥的研究

现代食品科技ModernFoodScienceandTechnology2008,Vol.24,No.8745黑曲霉菌丝体真空冷冻干燥的研究丁春杰1,2，肖更生1，陈卫东1，徐玉娟1，张友胜1，吴继军1，金盛楠1,2（1.广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所，广东广州510610）（2.江西农业大学生物与工程学院，江西南昌330045）摘要：本文研究了黑曲霉（ATCC16404）菌丝体真空冷冻干燥的保藏方法，并从培养基和保护剂对冻干菌的影响进行了研究，初步确定了高活菌数的增殖培养基。比较了不同保护剂对菌丝体成活率的影响，确定了最佳保护剂，活菌数达到109cfu/g。关键字：黑曲霉菌丝体；增殖培养基；冷冻干燥；保护剂中图分类号：TS201.1；文献标识码：A；文章篇号:1673-9078(2008)08-0745-04PreservationoftheMyceliumofAspergillusNigerbyFreezeDryingDINGChun-jie1,2,XIAOGeng-sheng1,CHENWei-dong1,XUYu-juan1,ZHANGYou-sheng1,WUJi-jun1,JINSheng-nan1,2（1.TheSericulture&FarmProduceProcessingResearchInstituteofGuangdongAcademyofAgriculturalSciences,Guangzhou,Guangdong510610,China）（2.DepartmentofBioengineeringofJiangxiAgriculturalUniversity,Nanchang,Jiangxi330045,China）Abstract:Inthispaper,thepreservationofthemyceliumofAspergillusnigerbyfreezedryingwasintroduced,andtheeffectsoftheculturalmediumandfreeze-dryingprotectantwereinvestigated.TheenrichmentculturemediumforAspergillusnigerwithhighviablecellsnumberandthebestfreeze-dryingprotectantweredetermined,withwhichtheviablecellsnumberofAspergillusnigertreatedbyfreezedryingwere109cfu/g.Keyword:Aspergillusniger;enhancingculture;freezedrying;protectingagent黑曲霉菌种保藏多是用孢子的冷冻干燥，但在作为指标菌进行杀菌效果检测等情况下，需要大量能快速繁殖的黑曲霉菌丝体，而液体发酵培养菌丝体不便于携带和保存，活力容易退化，因此需要一种可以解决菌丝体保藏的方法。在众多的保藏方法中，真空冷冻干燥法具备了低温、真空和干燥的条件，有利于提高黑曲霉菌丝体的成活率和保存时间[1]。在菌株被再次使用时，只需简单活化即可，十分方便，其保藏效果也较其它方法为优[2]。冷冻干燥是一个多步骤过程，会产生多种应力使样品变性，如低温应力、冻结应力和干燥应力。冷冻十燥过程会造成细胞膜通透性改变、蛋白质变性失活、pH的动态平衡被破坏、DNA损伤和膜脂肪酸组成发生改变等[3]。本研究首先通过选择不同培养基进行发酵培养获得高浓度的菌丝体，进而研究不同冻干条件及收稿日期：2008-03-06基金项目：国家科技支撑计划（2006BAD05A02-01）、2006年省部产学研结合项目（2006D90204006）资助作者简介：丁春杰（1980-），男，在读硕士研究生；研究方向：食品微生物通讯作者：吴继军，研究方向为食品加工。保护剂对冻干菌丝体活力的影响。1材料与方法1.1供试菌株黑曲霉（ATCC16404）：购自广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心的斜面菌种。1.2试剂与仪器1.2.1试剂甘油：分析纯；脱脂乳：市售；海藻糖：食品级；其他：分析纯1.2.2仪器电热恒温培养箱；真空抽滤机；高压灭菌器；超净工作台；显微镜；（FJ-200）匀质机；低温冰箱；（LABCONCOFreeZone7948030）冷冻干燥机等。1.3培养基及保护剂斜面培养基：蔗糖30g，NaNO33g，MgSO40.5g，KCl0.5g，FeSO40.01g，K2HPO41g，琼脂20g，将上述各组分溶于1000mL水中，121℃灭菌20min，备用。增殖培养基（1）：蔗糖30g，NaNO33g，MgSO4现代食品科技ModernFoodScienceandTechnology2008,Vol.24,No.87460.5g，KCl0.5g，FeSO40.01g，K2HPO41g，将上述各组分溶于1000mL水中，自然pH值，121℃灭菌20min，冷却，备用。增殖培养基（2）：马铃薯200g去皮，切成块煮沸30min，然后用纱布过滤，再加入蔗糖20g，酵母膏5g，溶化后补足水至1000mL，自然pH值，121℃灭菌30min，冷却，备用。增殖培养基（3）：麦芽汁培养基，121℃灭菌20min，冷却，备用。计数培养基：马丁氏（Martin）琼脂培养基保护剂：生理盐水；10%海藻糖；10%脱脂乳；10%甘油；10%海藻糖与10%脱脂乳混合液。用蒸馏水溶解，搅拌均匀，115℃灭菌15min后备用[4]。1.4工艺流程平板计数测最大菌密度↑斜面菌株→活化→摇瓶扩大培养→镜检→真空抽滤→无菌水清洗→匀质机粉碎→菌体与保护剂1:1等体积均匀混合→真空冷冻干燥→平板计数法测定成活数[5]1.5菌丝体培养与收集菌体培养：斜面菌株生成的孢子制备成高浓度孢子菌悬液，接种于500mL三角瓶中，每瓶装100mL增殖液体培养基中摇瓶培养，在温度28℃，转速200r/min条件下培养72h[6]。菌体收集：将培养液真空抽滤，弃去上清液。然后匀质机粉碎，将菌体中加入等质量保护剂，充分振荡使菌体分散，与保护剂混合均匀[2]。1.6真空冷冻干燥预冻：本实验采用-80℃预冻2h后进行干燥。干燥过程：第一阶段干燥．样品温度分别控制在-15℃14h，10℃10h，真空度为150Pa，直到样品的水分升华除去90%；第二阶段干燥。升高板层温度至20℃，迅速蒸发样品中的残余水分。该过程大约需要10h。将冻干菌存放于4℃~10℃冰箱中备用[7]。1.7冻干菌的存活记数取经不同保护剂处理的黑曲霉菌体冻干粉1g，用无菌生理盐水溶解制成菌悬液，然后将其稀释，再分别取稀释度为10-4、10-5和10-6的菌悬液0.1mL涂布接种于计数培养基内，每个稀释度涂布3个培养皿，28℃培养72h观察计数，取其平均值，以考察处理方式和不同保护剂对冻干菌的影响。2结果与讨论2.1不同接种量对菌丝体浓度的影响分别以5%、10%、15%接种量，在温度28℃，转速200r/min条件下摇瓶培养72h后，取100mL菌悬液，真空抽滤，烘干称量菌丝体干重，结果见图1。图1不同接种量对菌丝体生长的影响Fig.1Effectofinoculumsizeonthegrowthofthemycelium由图1可知，10%接种量为昀适接种量，菌丝体干重达到9.4×10-2g/mL。2.2不同增殖培养基对菌丝体浓度的影响在上述实验昀适接种量10%基础上，分别以3种不同增殖培养基，在温度28℃，转速200r/min条件下摇瓶培养72h后，取100mL菌悬液，真空抽滤，烘干称量菌丝体干重，结果见图2。图2不同增殖培养基对菌丝体生长的影响Fig.2Effectofenrichmentculturemediumsonthegrowthofthemycelium由图2可知，增殖培养基（3）即麦芽汁培养基为昀适摇瓶培养基。增殖培养基（1）、（2）在液体培养中，菌丝体呈球状，且随接种量的增加，菌丝球无明显增加现象。增殖培养基（3）在培养过程中，菌丝体呈丝状，摇瓶培养72h后，培养液为透明粘稠液体。由以上现象可知，增殖培养基（1）、（2）营养不足大量数量孢子萌发，菌丝体数量少。麦芽汁培养基更适合孢子萌发，形成大量菌丝体。2.3均质条件对菌丝体浓度的影响以10%接种量、增殖培养基（3）为基础，在10%脱脂乳为保护剂的条件下，比较均质条件对冻干菌丝体成活率的影响，结果如图3。现代食品科技ModernFoodScienceandTechnology2008,Vol.24,No.8747图3均质条件对冻干菌的影响Fig.3Effectofhomogenizationonthegrowthofthefreezedriedmycelium在均质条件(转速2000r/min，1~2min)下，菌丝体被打碎，能够与保护剂充分均匀混合，在冷冻过程中更能提高保护剂的保护作用，所以结果如图3所示，均质条件使活菌成活率提高3个数量级以上。2.4不同保护剂对冻干菌的影响在冷冻干燥过程中，微生物将经历冷冻和干燥两个过程。冷冻和干燥过程中会使部分菌丝体细胞损伤、死亡及某些蛋白酶分子钝化。因此，为降低恶劣条件对菌体造成的危害程度，昀大限度地提高菌体的存活率，达到保护效果，必须添加保护剂。保护剂可以改变生物样品冷冻干燥时的物理、化学环境，减轻或防止冷冻干燥或复水时细胞的损害，尽可能保持原有的各种生理生化特性和生物活性。以不同保护剂冷冻干燥，平板记数测每克冻干菌中活菌数，结果见图4。图4不同保护剂对冻干菌的影响Fig.4Effectoffreezedryingprotectantsonthegrowthofthefreezedriedmycelium注：1-生理盐水；2-10%海藻糖；3-10%脱脂乳；4-10%甘油；5-10%海藻糖+10%脱脂乳保护剂可分为单一保护剂和复合保护剂。单一保护剂又分为大分子保护剂、寡糖类保护剂以及其他单分子保护剂[8]。如图2所示，在本实验中，大分子保护剂选用10%脱脂乳，寡糖类保护剂选择10%海藻糖，其他单分子保护剂选用10%甘油。复合保护剂选择10%海藻糖+10%脱脂乳。大分子物质（10%脱脂乳）能够显著提高菌丝体的存活率，这可能是因为脱脂乳不仅像其它物质一样起到保护层的作用，而且脱脂乳中的乳清蛋白在菌体表面形成蛋白膜，对细胞加以保护，并可以固定冻干的酶类，防止由于细胞壁蛋白质损坏而引起的胞内物质泄漏。同时脱脂乳中还含有乳糖，也可以起到保护作用[9]。寡糖类保护剂（10%海藻糖）也能显著提高菌体的存活率，证实了“海藻糖具有稳定细胞膜和蛋白质机构、抗逆保鲜的作用，在微生物保藏方面有着其明显的优势”这一结论。这可能是因为海藻糖不仅具备一般寡糖的保护作用，而且具有在高温、高寒、高渗透、高压及干燥失水等恶劣环境条件下在细胞表面能形成独特的保护膜，有效地保护蛋白质分子不变性失活，从而维持生命体的生命过程和生物特征的特性。有研究认为，海藻糖对酶的保护机理为一方面海藻糖的羟基替代了水分子与酶的酰胺基形成氢键；另一方面海藻糖分子包裹在酶分子周围，或填充在酶蛋白分子的空间结构内，特别是酶的活性部位附近，形成玻璃态，有效地防止蛋白质分子发生三维结构的变化，从而避免了酶的失活[10]。其他单分子保护剂（10%甘油）也可以提高菌体的存活率。但效果没有10%脱脂乳以及10%海藻糖效果好。复合保护剂是选择两种保护效果好的的单一保护剂混合，其效果显著提高。这主要是因为不同的保护剂各有优缺点，不能完全满足菌体抵抗外界恶劣的条件。只有利用复配的保护剂才能昀大限度地使菌体在冻干过程中免受损伤。所以本实验采用10%脱脂乳+10%海藻糖的复合保护剂作为黑曲霉菌丝体的昀终保护剂。3结论本研究以黑曲霉菌丝体为研究对象，对其接种量、增殖培养基进行选择，并对其冷冻干燥的保护剂进行了筛选。昀终得出结论如下：10%接种量为昀适接种量，增殖培养基（3）即麦芽汁培养基营养丰富，适合大量黑曲霉