色谱柱技术2014.10。27+

L/O/G/O色谱柱技术王怀松[e-mail](Recorder)orCollection项取决于柱效，n↑，a项↑b、c项相关:在GC中：b项主要受色谱柱性质影响c项主要受柱温影响在HPLC中：b项主要取决于流动相的种类c项主要取决于流动相的配比柱分离机制：柱的填装色谱装柱：匀浆法首先清洗色谱柱和装柱系统。2.固定相3.0g分散于30mL异丙醇，超声波处理5min，以充分分散固定相并去除空气。然后迅速将配好的匀浆加入匀浆管中，并迅速接到装柱装置上。用正己烷/异丙醇(90/10，v/v)作顶替液，打开高压阀，开泵，并同时打开色谱柱出口的封头。3.以常见的5µm多孔硅胶填料为例，填装压力为50MPa左右(细孔硅胶可至70MPa)，装柱时间为30min4.拆下己填装好的柱子并装配上带有筛板(滤网)的柱头(注意:一定要将沾在柱头锥套上的填料除净，否则会影响到柱子的密封性)，做好标记，即已完成柱子的填装无机基质材料在正相色谱中，一般采用极性键合固定相，硅胶表面键合的是极性的有机基团，键合相的名称由键合上去的基团而定。最常用的有氰基（-CN）、氨基（-NH2）、二醇基（DIOL）键合相。流动相一般用比键合相极性小的非极性或弱极性有机溶剂，如烃类溶剂，或其中加入一定量的极性溶剂（如氯仿、醇、乙腈等），以调节流动相的洗脱强度。通常用于分离极性化合物。一般认为正相色谱的分离机制属于分配色谱。组分的分配比K值，随固定相极性的增加而增大，但随流动相中极性调节剂的极性增大（或浓度增大）而降低。同时，极性键合相的极性越大，组分的保留值越大。该法主要用于分离异构体，极性不同的化合物，特别是用来分离不同类型的化合物。无机基质材料二氧化硅基质第一步正硅酸乙酯水解形成羟基化的产物和相应的醇，第二步硅酸之间或硅酸与正硅酸乙酯之间发生缩合反应。实际上第一步和第二步的反应是同时进行的，其过程是非常复杂的，因此要独立地描述水解和缩聚反应过程几乎是不可能的，反应生成物是不同大小和结构的溶胶粒子。无机基质材料此类键合相一般分两步进行。首先使硅胶表面的硅醇基(Si-OH)氯化，然后氯化硅胶再与伯胺反应生成硅氮键型键合相。表面修饰方法无机基质材料化学键合色谱具有下列优点：（1）适用于分离几乎所有类型的化合物。一方面通过控制化学键合反应，可以把不同的有机基团键合到硅胶表面上，从而大大提高了分离的选择性；另一方面可以通过改变流动相的组成合乎种类来有效地分离非极性、极性和离子型化合物。（2）由于键合到载体上的基团不易被剪切而流失，这不仅解决了由于固定液流失所带来的困扰，还特别适合于梯度洗脱，为复杂体系的分离创造了条件。（3）键合固定相对不太强的酸及各种极性的溶剂都有很好的化学稳定性和热稳定性。（4）固定相柱效高，使用寿命长，分析重现性好。无机基质材料亲水作用色谱(hydrophilicinteractionliquidchromatography，HILIC)HILIC采用极性固定相和水-水溶性有机溶剂(主要为乙腈，含量大于60%)为流动相，为强极性和离子型化合物包括氨基酸、碳水化合物、极性药物、多肽、天然产物等的分离分析提供了一个很好的选择。作为一种新型的色谱分离手段，HILIC克服了正相色谱和反相色谱在极性化合物分离过程中的不足，同时能够提供与反相色谱截然不同的分离选择性。此外，由于其流动相含有高浓度的有机溶剂，有利于增强电喷雾离子源质谱(ESI-MS)的离子化效率进而提高检测灵敏度，与质谱具有很好的兼容性。因此，近年来涉及HILIC的研究和应用一直持续而稳定地增长，关于HILIC材料及应用、分离机理和分离效率的系统综述也层出不穷。无机基质材料亲水作用色谱(hydrophilicinteractionliquidchromatography，HILIC)无机基质材料反相色谱填料在反相色谱中，一般采用非极性键合固定相，如硅胶-C18H37（简称ODS或C18）硅胶-苯基等，用强极性的溶剂为流动相，如甲醇/水，乙腈/水，水和无机盐的缓冲液等。目前，对于反相色谱的保留机制还没有一致的看法，大致有两种观点：一种认为属于分配色谱，另一种认为属于吸附色谱。分配色谱的作用机制是假设混合溶剂（水+有机溶剂）中极性弱的有机溶剂吸附于非极性烷基配合基表面，组分分子在流动相中与被非极性烷基配合基所吸附的液相中进行分配。无机基质材料吸附色谱的作用机制是把非极性的烷基键合相，看作是在硅胶表面上覆盖了一层键合的十八烷基的“分子毛”，这种“分子毛”有强的疏水特性。当用水与有机溶剂所组成的极性溶剂为流动相来分离有机化合物时，一方面，非极性组分分子或组分分子的非极性部分，由于疏溶剂的作用，将会从水中被“挤”出来，与固定相上的疏水烷基之间产生缔合作用。另一方面，被分离物的极性部分受到极性流动相的作用，使它离开固定相，减少保留值，此即解缔过程。显然，这两种作用力之差，决定了分子在色谱中的保留行为。一般地，固定相的烷基配合基或分离分子中非极性部分的表面积越大，或者流动相表面张力及介电常数越大，则缔合作用越强，分配比也越大，保留值越大。在反相键合相色谱中，极性大的组分先流出，极性小的组分后流出。无机基质材料反相色谱填料固定相：非极性的反相介质，即为疏水性介质(R1,R2多为甲基，R为C4，C8，C18烷基或苯基，其中C18硅烷化制备的试剂最多，统称为ODS–Octadecylsilica)。烷基化密度：45%，55%的羟基用三甲基氯硅烷覆盖，使表面完全非极性化。流动相：极性有机溶剂的水溶液(甲醇，乙腈,异丙醇、正丙醇和四氢呋喃等)洗脱：[有机溶剂]增加。无机基质材料限进介质(restrictedaccessmaterial,RAM)生物样品中的残留分析是现在分析化学的研究热点。生物和环境样品基体复杂，如处理不当，生物大分子如蛋白质及核酸等，遇到疏水性反相填料时发生变性，造成填料孔径堵塞、使柱效降低、吸附容量下降、干扰小分子分析物的测定无机基质材料以硅胶微球为基质，应用表面引发的活性自由基聚合方法，以β-环糊精(β-CD)为手性选择试剂，合成了能用于生物样品手性分离的“梳状”限进材料。Trac-TrendsinAnalyticalChemistry,31(2012),96-108.(CH3)Cl等。无机基质材料生物大分子离子交换色谱分离离子交换色谱分离蛋白质的过程，主要是利用蛋白质具有彼此不同的电荷而进行选择性的分离。生物大分子所带净电荷的多少，是由其所带的氨基和羧基等可电离基团的数量以及环境pH值共同决定。无机基质材料亲和色谱（Affinitychromatography）填料无机基质材料亲和作用中的相互作用力•静电作用•氢键•疏水性相互作用•配位键•弱共价键无机基质材料影响亲和作用的因素•离子强度•pH•抑制氢键形成的物质•温度•螯合剂无机基质材料亲和层析原理亲和层析是利用偶联亲和配基的亲和吸附介质为固定相亲和吸附目标产物，使目标产物得到分离纯化的液相层析法无机基质材料亲和配基•酶的抑制剂:大豆胰蛋白酶抑制剂•抗体：抗体-抗原，Ka=107-1012。单抗免疫亲和层析•A蛋白：与免疫球蛋白IgG结合。•凝集素：与糖特异性结合的蛋白。伴刀豆球蛋白。•辅酶和磷酸腺苷：辅酶I，与脱氢酶，激酶结合。•三嗪类色素：分子内含三嗪环的合成活性染料。ReactiveBlue2与脱氢酶，激酶结合。•过渡金属离子:Cu2+,Ni2+,Zn2+•组氨酸:咪唑环，静电和疏水作用。•肝素：哺乳动物的脏器内的酸性多糖物质，与脂蛋白，脂肪酶抗凝血酶等结合。•肽配基无机基质材料硼亲和色谱硼亲和（BA)相关的技术是选择性富集分离顺式二羟基分子的一种功能强大的工具。目前已经广发用于对顺式二经基分子的分离分析，如糖蛋白、核苷和糖。手性色谱填料蛋白质手性固定相利用蛋白质中的氨基或羧基将蛋白质键合到经修饰的硅胶上，修饰硅胶的官能团可以是环氧基、氨基或醛基等。现在已经有多种蛋白质手性固定相被商品化，常用的固定化蛋白质主要有：酸性糖蛋白(AGP)，牛血清白蛋白(BSA)，人血清白蛋白(HSA)，卵粘蛋白(OVM)，以及一些酶(如纤维素酶等)。ChiralAGP主要用于分离仲胺、季铵及含氮杂环化合物。ChiralCBH是一种把纤维二糖水解酶键合到硅胶载体上制得的一种有效CSP。主要用于反相分离常用药物，如伯胺、肾上腺素等。常用的流动相为异丙醇或乙睛的磷酸盐缓冲溶液。这几种手性固定相色谱行为很相似，保留时间和手性选择