亲水作用色谱HILIC实用指南

指导与应用手册·1©版权所有,2005-2008,MerckSeQuantAB亲水作用色谱HILIC实用指南指导与应用手册2·HILIC实用指南亲水作用色谱(HILIC)实用指南原著作书名:APracticalGuidetoHILIC原著作者:PatrikAppelblad,TobiasJonsson,EinarPontén,CamillaViklundandWenJiang中文版编辑：WenJiang(江文）ISBN978-91-631-8370-6瑞典SeQuantAB出版,地址:Box7956,90719Umeå,Sweden.版权所有©2005-2008,SeQuantAB2008年2月第一版，第一次印刷，瑞典于默奥(Umeå)修订及额外资料可以在MerckSeQuant公司网页上找到，网址。如有其它问题及信息反馈，请与[e-mail]联系。©版权所有,2005-2008,SeQuantABHILIC实用指南–指导与应用手册引言本手册旨在介绍一种适用于分析强极性和强亲水化合物的液相色谱分析方法–亲水作用液相色谱(HydrophilicInteractionLiquidChromatography，HILIC)。主要介绍HILIC的基本理论和该分离模式下的一些实际问题，同时给读者介绍瑞典SeQuant公司的ZIC®-HILIC(硅胶基质)和ZIC®-pHILIC(聚合物基质)两性离子液相色谱柱(见图1)，以及使用这两种色谱柱分析不同类型亲水化合物的应用实例。您也会从本手册中获得该类色谱和其他方面的色谱知识。图1ZIC®-HILIC和ZIC®-pHILIC两性离子固定相的官能团如果本手册不能解决您的HILIC问题，SeQuant愿为你提供进一步帮助。首先，建议您登陆SeQuant公司网站主页()，从那您能找到关于我们产品的最新文献资料、应用报告和技术数据。如果您还需要其他信息，SeQuant工作人员乐意为您提供更进一步帮助,请与我们的技术支持联系([e-mail])。为什么使用HILIC?尽管反相液相色谱（RPLC）是至今应用最广的色谱分离技术，它能与各种常规的检测方法结合，解决多种分析应用问题，但对某些分析物，特别是极性和亲水性化合物却无法或很少保留。长期以来，人们采用正相液相色谱(NPLC)，并使用不利环保的非水溶性流动相如己脘或环己脘来分析这些物质。但是在这种实验条件下，很多极性和亲水化合物往往很难溶解，从而限制了NPLC的应用范围。从现在起有了另一种新的解决办法，即选用亲水作用液相色谱-HILIC。在HILIC色谱柱上，物质的洗脱顺序与RPLC恰恰相反，如图2所示。换句话说，在RPLC柱上很难保留或根本不保留的物质，在通常的实验条件下，它们在HILIC柱上有较强的保留。图2小肽在HILIC和RPLC柱上的分离色谱柱:1)ZIC®-HILIC，150x4.6mm；2)Kromasil®C18,150x4.6mm；流动相：HILIC-60/40(v/v)乙腈/10mM乙酸铵，pH7；RPLC-5/95(v/v)乙腈/10mM乙酸铵，pH7；样品:1)Phe-Gly-Gly-Phe；2)Leu-Gly-Gly；3)Gly-Gly-GlyHILIC技术和传统的NPLC有很多相似的之处，但又和它有很大的不同，最重要的不同点是它使用与RPLC的流动相组份相似的半水溶性流动相，使待分析物和样品的基质在流动相中的溶解度大大提高。典型的HILIC流动相是由水或挥发性缓冲盐溶液以及40-97％的乙腈组成的，这些决定了HILIC很适合与质谱检测器(MS)或蒸发光散射检测器(ELSD)联用。在分析亲水化合物时，如将反向色谱改换成亲水作用色谱，检测灵敏度通常会提高10-1000倍。另外，使用亲水作用液相色谱还可避免使用离子对试剂，这对于制备型色谱分离是很有益的。4·HILIC实用指南相同。但由于其流动相与RPLC相似，人们可能会试图使用RPLC常规的样品制备和净化方法用于HILIC分析，这样往往会给广大色谱工作者制造很多麻烦。因此，随后的几个章节将详细讨论HILIC色谱系统的关键部件以及成功操作的方法，同时也会描述这些建议的理论根据。HILIC色谱柱HILIC柱的固定相是亲水的，而且通常在一定pH范围内是带电荷的。待分析物与固定相相互作用在一般情况下是：亲水性越强的化合物，被保留的时间越长。和大多数其他液相色谱技术不同的是HILIC的部分流动相是作为固定相的一部分来起作用的(具体原理在下面章节介绍)，因此关键的是要在流动相中保持一定量的水。一般情况下，水的比例应保持在3-60%的水平。HILIC的保留特性在HILIC工作条件下，固定相表面会首先建立一个富集水的液体层，待分析物在流动相和该亲水层之间进行分配，从而实现分离(见图3)。这是一个典型的放热过程，氢键作用和偶极间的相互作用是影响保留强弱的主要因素。当然氢键作用的大小会取决于物质的酸碱度，而偶极-偶极相互作用会取决于物质的偶极矩与极化性。HILIC固定相的主要作用是固定水，但如果固定相是带电荷的，离子静电作用也会影响化合物在色谱柱上的保留。图3示意性地描述了两性离子固定相对极性和亲水化合物的保留机理。二级交互作用除了HILIC中亲水分配的初级保留作用以外，带电荷的固定相往往提供第二个十分重要的、有选择性的保留作用，也就是它的选择性大小还取于待分析物和固定相上电荷之间的静电作用。降低静电作用可以通过提高流动相中盐或缓冲盐的浓度来调节。高缓冲盐浓度破坏固定相与待分析物的相互作用，把分析物有效地洗脱出来。但是，高的的缓冲盐浓会增加质谱检测的离子抑制现象，从而对检测灵敏度产生负面影响。然而在两性离子固定相中，每个电荷的静电作用都会被邻近的反向电荷部分地平衡或抵消，因此，总的静电作用是比较弱的，见图4。较弱的静电作用允许流动相使用较低的缓冲盐浓度，这对提高质谱检测器(MS)的检测灵敏度是有利的。中性的HILIC固定相一般也需要较低的缓冲液浓度，但它缺乏带电荷固定相的二级选择性。图3两性离子固定相上通过亲水分配和与静电作用的分离的HILIC保留机理1)待分析物在流动相和固定相水层间的亲水分配作用；2)待分析物与固定相季胺阳离子的静电作用；3)待分析物与磺酸根阴离子的静电作用。图4血管舒缓激肽(pI12)在不同HILIC固定相上的保留；色谱柱：100x4.6mm；1)两性离子色谱柱；2)纯硅胶色谱柱。流动相：40/60(v/v)乙腈/50mM乙酸铵缓冲液，pH6.5指导与应用手册·5©版权所有,2005-2008,SeQuantAB弱离子交换剂(即纯硅胶和氨基相)也可用做HILIC固定相，但它们的电荷密度与流动相pH值有关，这样，静电作用会既取决于溶质的离子化也取决于固定相的离子化，使得开发或优化分离条件变得复杂化。然而非pH依赖性的固定相，如两性离子固定相，流动相的最佳pH值主要由待分析物来决定。对于某些类别的化合物，如酚类化合物，提高流动相的pH值会有利于它们的分离，见图5。这种类型的分离需要使用聚合物基质的两性离子HILIC色谱柱，因为当pH大于7.5时，硅胶的稳定性变差。图5pH对龙胆酸、原儿茶酸和异酞酸分离的影响色谱柱：ZIC®-pHILIC100x4.6mm；流动相：左图-75/25(v/v)乙腈/17mM乙酸铵，pH6.8；右图-75/25(v/v)乙腈/17mM碳酸氢铵，pH9.6色谱柱的选择选择合适的色谱柱主要取决于待分析物的性质，但也需要适当考虑样品的基质。当然，柱子的选择性和保留容量是最重要的参数，另外还有柱效。分离容量柱容量是一个非常重要的参数，因为它决定着保留时间，也决定着洗脱待分析物所要求的洗脱强度。如果容量过高，需要使用过强的流动相，相反，容量过低，分析的动态范围变小，柱子容易过载。HILIC色谱柱中填料的表面积和固定相结合水的能力都会影响柱容量。对于带电荷的固定相，其电荷密度也会影响柱容量。待分析物的保留因子k(也称为容量因子或表示为k’)可以用它通过柱子的相对速度来表示，可用公式[1]来计算：kA=(tR-t0)t0[1]式中：tR为溶质的保留时间；t0泵出系统死(空)体积所需的时间。分离的选择性柱子的选择性取决于几个因素，如填料的基质材料和官能团的化学结构，因此，选择性是基于柱子的本身的特性以及它和待分析物的交互作用为基础的。选择性因子(分离度)，α，可度量两个相邻被洗脱的溶质A和B分离的好坏，计算见公式[2]。α=kBkA[2]式中kA和kB分别为先后洗脱的两个化合物的保留因子。分离效率一个好的色谱柱能用较少的流动相将某类溶质全都洗脱下来。与大体积的洗脱相比，它的色谱峰会有较小的峰宽，当然峰也会高一点，分离效果也就更好。为了能够比较不同柱子的柱效，还应考虑峰的保留时间。柱效用理论塔板数来表示，计算公式见：N=5.54⎝⎜⎛⎠⎟⎞tRw½2[3]式中w1/2是峰高一半处峰的宽度；柱效的决定因素是溶质通过该柱时它与分离材料相互作用的机会的多少，这种相互作用数被称作“塔板数”，它是从蒸馏理论中借用的术语。如果每次溶质只在流动相和固定相表面的滞留水层间达到新的分配平衡，那么传输的距离越短，理论塔板数就越高。6·HILIC实用指南大的死体积会降低柱效空体积亦称为死体积，是指从进样器至检测器间液体的总体积。死体积的大小决定了一个不被填料保留的化合物从进样器到达检测器的时间(t0)。死体积（V空或V0）是柱内与柱外空体积之和：V0=V空＝V柱＋V柱外[4]色谱柱的死体积（V柱）是柱子多孔填料颗粒内孔洞的总体积和颗粒间体积的总和。对于一个固定尺寸的柱子，其死体积基本是恒定的，而且与填料的粒径无关。峰加宽的重要来源是柱外的死体积(V柱外)，即进样环、管路和检测器的体积。为了将峰加宽减至最小，且不致破坏高质量色谱柱所获的柱效，用减小系统中连接各部件的所有管线内径来减小死体积的效果是很有限的，这样柱反压会增大，并且会造成意外管线堵塞等。为减小死体积,所有的连接管线应尽可能的短!还应注意高压泵至进样器间的体积对峰扩散并不重要，但是如果太大，那么在更换流动相时会花较长的时间。下表给出了10cm的不同内径的管线所产生的死体积。表110cm的几种最常用内径管线的体积管线内径体积(mm)(inch)(µL)0.0640.0250.320.130.051.30.170.072.30.250.104.90.500.2020色谱柱的维护多数的HILIC柱都是以微粒硅胶为基质制作的，因此不能在高pH环境下使用。以硅胶为基体的ZIC®-HILIC色谱柱的pH适用范围是pH3-8，而以聚合物为基质的ZIC®-pHILIC柱的适宜范围是pH2-10。HILIC柱应在HILIC条件下保存，通常建议保存在有机溶剂和水或低浓度缓冲液的混合溶液中。不同牌号的HILIC柱可能有其他的存放方法，因此在打算长时间存放柱子之前，要仔细阅读说明书了解具体存放方法。SeQuant公司建议ZIC®-HILIC和ZIC®-pHILIC色谱柱的贮存和它们的装运条件一样，保存在:•80/20(v/v)乙腈/5mM乙酸铵溶液,pH6.8色谱柱的再生当发现HILIC柱出现分离效率变差（峰加宽）、保留时间改变和校准曲线偏离等现象时，很可能是由于固定相上结合了强保留的“脏东西”（色谱柱保留了一些不希望保留的物质），而使柱容量改变了。如果柱反压升高，常常是因为样品基质中的某些组分形成沉淀，堵塞了色谱柱入口的多孔滤片。通常可用强缓冲液或盐溶液在低流速下反向冲洗色谱柱来部分恢复柱子的性能，此时应将柱出口直接接到废液桶。SeQuant建议用如下步骤来再生和去除沉淀，但是应注意其他厂家可能有不同的建议。•30个柱体积的去离子水•30个柱体积的0.5M