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第七章微生物的生长及其控制第一节微生物生长的测定一、微生物的纯培养在微生物学中,在人为规定的条件下培养、繁殖得到的微生物群体称为培养物(culture),而只有一种微生物的培养物称为纯培养物(pureculture)。由于在通常情况下纯培养物能较好地被研究、利用和重复结果,因此把特定的微生物从自然界混杂存在的状态中分离、纯化出来的纯培养技术是进行微生物学研究的基础。(一)倾注平板法(pourplatemethod)这是最常用的纯种分离法,先将待分离的材料作一系列的稀释(如1:10、1:100、1:1000、1:10,000……),然后分别取不同稀释液少许,与已熔化并冷却至45℃的琼脂培养基相混合,摇匀后,倾入灭过菌的培养皿中,待琼脂凝固后,保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当,平皿上就可出现分散的单个菌落,这个菌落可能就是由一个细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落,或重复以上操作数次,便可得到纯培养。(二)涂布平板法(spreadplatemethod)由于将含菌材料先加到还较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡,而且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长,因此在微生物学研究中更常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已熔化的培养基倒人无菌平皿,制成无菌平板,冷却凝固后,将一定量的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面,再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面,经培养后挑取单个菌落。(三)平板划线法(streakplatemethod)用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料,在无菌平板表面进行平行划线、扇形划线或其他形式的连续划线,微生物细胞数量将随着划线次数的增加而减少,并逐步分散开来,如果划线适宜的话,微生物能一一分散,经培养后,可在平板表面得到单菌落。(四)稀释摇管法(dilutlonshakeculturemethod)用固体培养基分离严格厌氧菌有它特殊的地方。如果该微生物暴露于空气中不立即死亡,可以来用通常的方法制备平板,然后置放在封闭的容器中培养,容器中的氧气可采用化学、物理或生物的方法清除。对于那些对氧气更为敏感的厌氧性微生物,纯培养的分离则可采用稀释摇管培养法进行,它是稀释倒平板法的一种变通形式。先将一系列盛无菌琼脂培养基的试管加热使琼脂熔化后冷却并保持在50℃左右,将待分离的材料用这些试管进行梯度稀释,试管迅速摇动均匀,冷凝后,在琼脂柱表面倾倒一层灭菌液体石蜡和固体石蜡的混合物,将培养基和空气隔开。培养后,菌落形成在琼脂柱的中间。进行单菌落的挑取和移植,需先用一只灭菌针将液体石蜡—石蜡盖取出,再用一只毛细管插入琼脂和管壁之间,吹入无菌无氧气体,将琼脂柱吸出,置放在培养皿中,用无菌刀将琼脂柱切成薄片进行观察和菌落的移植。(五)液体稀释法大多数细菌和真菌,用平板法分离通常是满意的,因为它们的大多数种类在固体培养基上长得很好。然而迄今为止并不是所有的微生物都能在固体培养基上生长,例如一些细胞大的细菌、许多原生动物和藻类等,这些微生物仍需要用液体培养基分离来获得纯培养。稀释法是液体培养基分离纯化常用的方法。接种物在液体培养基中进行顺序稀释,以得到高度稀释的效果,使一支试管中分配不到一个微生物。如果经稀释后的大多数试管中没有微生物生长,那么有微生物生长的试管得到的培养物可能就是纯培养物。如果经稀释后的试管中有微生物生长的比例提高了,得到纯培养物的机率就会急剧下降。因此,采用稀释法进行液体分离,必须在同一个稀释度的许多平行试管中,大多数(一般应超过95%)表现为不生长。(六)单细胞(孢子)分离稀释法有一个重要缺点,它只能分离出混杂微生物群体中占数量优势的种类,而在自然界,很多微生物在混杂群体中都是少数。这时,可以采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养,称为单细胞(单孢子)分离法。单细胞分离法的难度与细胞或个体的大小成反比,较大的微生物如藻类、原生动物较容易,个体很小的细菌则较难。这种方法是从待分离的材料中挑取一个细胞来培养,从而获得纯培养。具体方法是将显微镜挑取器装置在显微镜上,把一滴菌悬液置于载玻片上,用安装在显微镜挑取器上的极细的毛细吸管,在显微镜下对准某一个单独的细胞挑取,再接种到培养基上培养。此法需要非常熟练的操作人员,多限于高度专业化的科学研究中采用。(七)选择培养分离不同微生物需要不同的营养物质。有些微生物生长适于酸性环境,有些则适于碱性环境。各种微生物对不同的化学试剂如消毒剂(酚)、染料(结晶紫等)、抗生素及其他物质等具有不同的抵抗能力。利用这些特性,便可配制成适合于某种微生物生长而限制其他微生物生长的各种选择性培养基,以达到纯种分离的目的。1、利用选择培养基进行直接分离主要根据待分离微生物的特点选择不同的培养条件,有多种方法可以采用。例如在从土壤中筛选蛋白酶产生菌时,可以在培养基中添加牛奶或酪素制备培养基平板,微生物生长时若产生蛋白酶则会水解牛奶或酪素,在平板上形成透明的蛋白质水解圈。通过菌株培养时产生的蛋白质水解圈对产酶菌株进行筛选,可以减少工作量,将那些大量的非产蛋白酶菌株淘汰;再如,要分离高温菌,可在高温条件进行培养;要分离某种抗生素抗性菌株,可在加有抗生素的平板上进行分离;有些微生物如螺旋体、粘细菌、蓝细菌等能在琼脂平板表面或里面滑行,可以利用它们的滑动特点进行分离纯化,因为滑行能伎它们自己和其他不能移动的微生物分开,可将微生物群落点种到平板上,让微生物滑行,从滑行前沿挑取接种物接种,反复进行,得到纯培养物。2、富集培养主要是指利用不同微生物间生命活动特点的不同,制定特定的环境条件,使仅适应于该条件的微生物旺盛生长,从而使其在群落中的数量大大增加,人们能够更容易地从自然界中分离到所需的特定微生物。富集条件可根据所需分离的微生物的特点从物理、化学、生物及综合多个方面进行选择,如温度、pH、紫外线、高压、光照、氧气、营养等等许多方面。例,采用富集方法从土壤中分离能降解酚类化合物对羟基苯甲酸(ρ-hydroxybezylacid)的微生物的实验过程:首先配制以对羟基苯甲酿为唯一碳源的液体培养基并分装于烧瓶中,灭菌后将少量的土壤样品接种于该液体培养基中,培养一定时间,原来透明的培养液会变得浑浊,说明已有大量微生物生长。取少量上述培养液转移至新鲜培养液中重新培养,该过程经数次重复后能利用对羟基苯甲酸的微生物的比例在培养物中特大大提高,将培养掖涂布于以对羟基苯甲酸为唯一碳源的琼脂平板,得到的微生物菌落中的大部分都是能降解对羟基苯甲酸的微生物。挑取一部分单菌落分别接种到含有及缺乏对羟基苯甲酸的液体培养基中进行培养,其中大部分在含有对羟基苯甲酸的培养基中生长,而在没有对羟基苯甲酸的培养基中表现为没有生长,说明通过该富集程序的确得到了欲分离的目标微生物。通过富集培养使原本在自然环境中占少数的微生物的数量大大提高后,可以再通过稀释倒平板或平板划线等操作得到纯培养物。二、微生物生长的测定微生物在适宜的环境条件下,不断地吸收营养物质,并按照自己的代谢方式进行代谢活动,如果同化作用大于异化作用,则细胞质的量不断增加,体积得以加大,于是表现为生长。简单地说,生长就是有机体的细胞组分(constituent)与结构在量方面的增加。单细胞微生物如细菌,生长往往伴随着细胞数目的增加。当细胞增长到一定程度时,就以二分裂方式,形式两个基本相的子细胞,子细胞又重复以上过程。在单细胞微生物中,由于细胞分裂而引起的个体数目的增加,称为繁殖。(一)微生物细胞数目的测定微生物特别是单细胞微生物,体积很小,个体的生长很难测定,而且也没有什么实际应用价值。因此,在微生物学的研究和应用中,通常是测定群体的增加量,即群体的生长。1、直接计数法--总菌计数①计数板计数法利用血球计数板在显微镜下直接计数,是一种常用的微生物计数方法。此法的优点是直观、快速。将经过适当稀释的菌悬液(或孢子悬液)放在血球计数板载玻片与盖玻片之间的计数室中,在显微镜下进行计数。由于计数室的容积是一定的(0.1mm3),所以可以根据在显微镜下观察到的微生物数目来换算成单位体积内的微生物总数目。由于此法计得的是活菌体和死菌体的总和,故又称为总菌计数法。②比例计数法将已知颗粒浓度的样品(例如血液)与待测细胞样品混匀后在显微镜下,根据二者之间的比例直接推算待测微生物细胞的浓度。2、间接计数法--活菌计数①平板菌落计数法菌落是指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成的能被肉眼识别的生长物,它是由数以万计相同的细菌集合而成。当样品被稀释到一定程度,与培养基混合,在一定培养条件下,每个能够生长繁殖的细菌细胞都可以在平板上形成一个可见的菌落。菌落总数就是指在一定条件下(如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等)每克(每毫升)检样所生长出来的细菌菌落总数。按国家标准方法规定,即在需氧情况下,37℃培养48h,能在普通营养琼脂平板上生长的细菌菌落总数,所以厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温的细菌,由于现有条件不能满足其生理需求,故难以繁殖生长。因此菌落总数并不表示实际中的所有细菌总数,菌落总数并不能区分其中细菌的种类,所以有时被称为杂菌数,需氧菌数等。菌落总数测定是用来判定食品被细菌污染的程度及卫生质量,它反映食品在生产过程中是否符合卫生要求,以便对被检样品做出适当的卫生学评价。菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。②液体稀释法对未知样品作10倍系列稀释。选适宜的3个连续的10倍稀释液各取5ml,接种到3组共15支液体培养基试管中,每管接入1ml,培养一定的时间后,计录每个稀释度出现生长的试管数,然后查MPN(mostprobablenumber,最近似数)表,根据样品的稀释倍数可计算出其中的活菌含量。3、其他计数法①比浊法微生物在液体培养基中生长,由于原生质含量的增加,引起培养物混浊度的增高。最古老的比浊法是采用McFarland比浊管,用不同浓度的BaCl2与稀H2SO4配制成的10支试管,其中形成的BaSO4有10个梯度,表示10个相对的细菌浓度(预先用相应的细菌测定)。某一未知浓度的菌液在透射光下用肉眼与某一比浊管进行比较,如果两者的浊度相当,即可目测出该菌液的大致浓度。精确的测定,要用分光光度计进行。在可见光的450~650nm波长内均可测定。②膜过滤法将适当孔径的滤膜放入滤器,过滤样品,由于滤膜的作用而将微生物保留在膜的表面上。样品中微生物生长抑制剂可在过滤后用无菌水冲洗滤器而除去。然后,将滤膜放在培养基上培养,营养物和代谢物通过滤膜的微孔进行交换,在滤膜表面上培养出的菌落可以计数,并和样品量相关。(二)微生物生长量的测定1、直接法①体积测量法:又称测菌丝浓度法。通过测定一定体积培养液中所含菌丝的量来反映微生物的生长状况。方法是,取一定量的待测培养液(如10毫升)放在有刻度的离心管中,设定一定的离心时间(如5分钟)和转速(如5000rpm),离心后,倒出上清液,测出上清液体积为v,则菌丝浓度为(10-v)/10。菌丝浓度测定法是大规模工业发酵生产上微生物生长的一个重要监测指标。这种方法比较粗放,简便,快速,但需要设定一致的处理条件,否则偏差很大,由于离心沉淀物中夹杂有一些固体营养物,结果会有一定偏差。②称重法可用离心或过滤法测定。一般干重为湿重的10-20%。在离心法中,将一定体积待测培养液倒入离心管中,设定一定的离心时间和转速,进行离心,并用清水离心洗涤1-5次,进行干燥。干燥可用烘箱在105℃或100℃下烘干,或采用红外线烘干,也可在80℃或40℃下真空干燥,干燥后称重。如用过滤法,丝状真菌可用滤纸过滤,细菌可用醋酸纤维膜等滤膜过滤,过滤后用少量水洗涤,在40℃下进行真空干燥。称干重发法较为烦琐,通常获取的微生物产品为菌体时,常采用这种方法,如活性干酵母(activitydryyeast,ADY),一些以微生物菌体为活性物质的饲料和肥料。2、间接法①含氮量测定法大多数细菌的含氮量为干重的12.5%,酵母菌为7.5%,霉菌为6.0%。总氮量与细胞粗蛋白的含量(因
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