临床微生物实验室必须进行规范化革命 张秀珍

全国基层医疗机构抗菌药物合理应用培训项目临床微生物实验室必须进行规范化革命张秀珍卫生部北京医院•人类面临着微生物的挑战,要打赢这场战争不仅需要有经验的医生,还需要一支优秀的侦察队伍—临床微生物检验队伍。临床细菌室规模和发展速度与10年或20年前相比已经发生了巨大的变化,但离CLSI(临床实验室标准化研究所)标准化文件要求还相差很远,基层细菌室必须进行规范操作革命才可能应对微生物向人类的挑战,才能适应临床的需要。参考CLSI文件从以下7方面提出建议•标本采集和运送的基本规范；•培养前标本质量检测基本规范；•标本分离的基本规范•细菌鉴定基本规范；•细菌药物敏感试验基本规范；•实验室质量保证基本规范；•细菌报告基本规范；一.标本采集和运送•标本采集和运送是细菌培养成功的最最重要的关键•但由于标本的采集和运送常有护士或医生或病人自己完成,所以也是最不容易做好的事情，而且不知道问题所在之处,造成的后果是:•临床医生最不能接受的问题:阳性率低、标本污染棉花纤维+竹/木条抑菌区是因为：植物分泌出来的：脂肪酸；树脂；福尔马林氯气，重金属与胶水的影响美国与欧洲对实验室的新要求NCCLSM40标准DIN58942标准推荐COPANAmies运送培养基多用途运送系统–需氧+厌氧低氧化的环境–不会对标本的微生物造成损害拭子是深入培养基中来保护苛养菌与厌氧菌两面是以塑料密封,不透水和漏气–减少污染和维持缺氧环境ASM2004流感嗜血杆菌在三种不同的运送基的存活率1.痰标本的采集和运送•1.标本采集时间：用抗生素前•2.采集方法：–自然咳痰：必须用请水漱口3次，应包括咽喉部，立即用力咳出痰，于灭菌容器中或输送培养基中。–支气管镜或支气管毛刷:由医生采集，建议直接种入输送培养基2.泌尿标本•1．采集后的标本应立即送检。•2．采集时间：多数药物从尿道排泄，所以不管用哪种方法都应在用药前采集。应采集早晨第一次的尿。•3标本管不应含防腐剂和消毒剂。泌尿标本•4.采集中段尿时要先用肥皂清洗女性的外阴和男性的外生殖器包括包皮内，然后用清水冲洗。•5.长期留置导尿管的患者应在更换新管时留取尿标本。•6.做厌氧培养时应膀胱穿刺采集尿。3.分泌物•1.对开放性病灶的采集：如眼结膜脓性分泌物、扁桃体、外耳道、手术后切口、导管治疗感染、瘘管内脓液、生殖道分泌物等均属于开放性病灶。应先用灭菌生理盐水冲洗表面污染菌，去除旧的分泌物，用灭菌拭子采集病灶深部的分泌物，也可取感染部位下的组织送检。•2.闭锁性脓肿：如淋巴脓肿、肺脓肿、肝脓肿、腹腔脓肿、盆腔脓肿等，对封闭的脓肿常采用穿刺或引流的的方法采样，应在用药前采集，应注意脓液的气味、性状、颜色注意厌氧菌存在的可能。不能及时送检应应用输送培养基。4.便标本•1.采集时间：腹泻患者应在用药前、急性期采集；沙门菌感染、肠热症应在2周内采；厌氧菌出现症状即采集。•2.采集方法：自然排便者可用小木棒挑取有脓血和黏液的部位的粪便2-3克，如液状粪便取絮状物盛于无菌的、密封的、不吸水的、容器内或直接盛于增菌液或保存液中；对不易获得粪便患者及幼儿，可用直肠拭子采集后置保存液或输送培养基中送检。便标本注意事项：•⑴虽然粪便标本本身含很多细菌但也要用无菌容器。•⑵在患者病情许可的条件下应在用药前采集标本。•⑶应床边接种或置输送培养基送检。•⑷厌氧细菌（难辩梭菌）培养的标本应尽量减少与空气接触。5.厌培养标本•1.痰标本的厌氧培养标本采集：必须用气管穿刺法获得痰液，从口腔吐出的痰标本不能用于厌氧培养。•2.尿标本的厌氧培养标本采集：耻骨上膀胱穿刺获得尿标本可用于厌氧菌培养3．便标本厌氧培养标本采集：可用排出的便做厌氧培养但也应少与空气接触。6.血液及骨髓标本•1.采血时间：尽可能在用抗生素前，心内膜炎例外。•2.采血量：采一次或采一瓶是错误的，至少应采一套2瓶，分需氧和厌氧。2瓶血量不少于16-20ml，先将10ml注入需氧瓶，再将剩余血采血注入厌氧瓶。•3.采血方法：不要与血气和血沉标本一起采血；不推荐血入瓶前换针头；不推荐静脉血直接入瓶；不宜在静脉导管或静脉留置口采血。血液及骨髓标本•4.采血间隔：如第一次采集2套（4瓶）血培养标本，在以后的2-5天不必采血，但除外心内膜炎和导管相关性败血症。•5.儿童：采血量是总血量的1%。•6.延迟培养瓶处理:延迟培养瓶不要放冰箱或孵箱，放常温，尽早送往临床细菌室。•7.皮肤消毒液推荐：建议先用70-80%异丙醇去脂，再用葡萄糖酸氯乙定消毒。抽血量和体重的关系2-340-60=36.322012.8-36.3262.1-12.7241.1-211-21套（需氧+厌氧）抽血量ml体重Kg二.标本培养前的基本规范1.痰培养标本•实验室在接种前必须作痰涂片革兰染色，当在低倍镜下白细胞小于10个每视野、上皮细胞大于25个每视野时应作为不宜做培养的标本；•当白细胞小于10个每视野，上皮细胞小于25个每视野时再参照油镜观察标本中细菌分布作出判断。痰培养标本•当标本中细菌种类超过3种以上，未见到钎毛拄状上皮细胞，作为不合格标本；如见到数量不等的白血胞或钎毛拄状上皮细胞或两者同在，含1-2种不同细菌，可考虑继续培养，结果可根据病情再作分析；当涂片中见到1-3种细菌，少量的扁平上皮细胞，少量或较多钎毛拄状上皮细胞均可按合格标本继续培养。2.厌氧培养•在正常上班时间：•申请厌氧培养的科室应邀请实验室，由临床医生或护士协作采集，细菌室行床边接种。•自然排出的尿标本、用棉拭子采集的分泌物、自然咳出的痰标本均为不合格的厌氧培养的标本，应于退检。•没有条件或不能及时送检的情况下均应用输送培养基放置标本。3.培养前应有涂片结果结合涂片推断定植菌或致病菌•⑴尿培养分离出3种以上的细菌，或分离出凝固酶阴性葡萄球菌、革兰阳性棒状杆菌等非定义为致病菌的细菌，涂片未见到，应在报告中提示可能是污染细菌建议结合临床表现考虑结果的参考价值。•⑵眼结膜拭子分离出凝固酶阴性葡萄球菌，涂片未见到，可能是污染细菌，应建议重送标本。培养结果结合涂片判断定植菌或致病菌•⑶前列腺液标本分离出凝固酶阴性葡萄球菌或革兰阳性小杆菌，涂片未见到，可能是污染细菌，应建议重送标本。•⑷当涂片中见到的细菌，并有细菌吞嗜现象存在，在培养时分离出该细菌可推测为致病菌。培养结果结合涂片判断定植菌或致病菌•（5）涂片报告的日期和培养报告日期要对应便于医生判别结果的参考价值.•（6）并每一视野可见到20个/油镜或该菌占所见到细菌的50%,可推测是标本中的优势细菌.有了合格的标本是保证培养成功的重要条件，但如果没有适宜的分离培养基和培养环境同样不能获得好的结果，为此制定如下基本条例以保证致病细菌分离成功。三.分离培养基本规范1.痰培养•1培养基：5%羊血琼脂、5%兔血巧克力琼脂、中国兰琼脂或伊红美兰、或加MRSA显色琼脂。•2．培养环境：5%羊血琼脂、5%兔血巧克力琼脂、置5-7%CO2、35℃环境培养，其他培养基置35℃空气培养。•3．结核培养：罗氏鸡蛋斜面，每一标本种2支，37℃空气培养。2.尿标本•1．培养基：5%羊血琼脂、中国兰或伊红美兰，或CP3尿致病菌分离显色琼脂。•2.菌落计数：每个标本都要做，用加样器或定量接种环取样本200ul分别接种于上述培养基均匀涂布整个平皿，此日作菌落计数。•3．培养环境：35℃空气环境培养3.便培养•1．培养基：中国兰或伊红美兰，沙门氏志贺氏琼脂（SS琼脂）或加沙门菌分离琼脂。•2．培养环境：35℃空气环境培养。•3．疑似伪膜性肠炎：5%羊血琼脂、沙保弱琼脂斜面、梭状芽孢杆菌分离琼脂（CCFA）。5%羊血琼脂、沙保弱琼脂斜面置35℃空气环境培养。CCFA置35℃厌氧环境培养。•其他特殊肠道致病菌培养按国家CDC要求执行。4.脑脊液培养•1．培养基：5%兔血巧克力琼脂、5%羊血琼脂。•2．培养环境：35℃，5-10%CO2环境培养。5.分泌物培养•1．培养基：5%羊血琼脂、5%兔血巧克力琼脂、中国兰或伊红美兰、葡萄糖肉汤•2．培养环境：35℃空气环境培养。6.胆汁或胸水或腹水•1．培养基：如标本量大时可按血液培养方法直接取16-20ml分别种入需氧和厌氧培养瓶。如标本量有限，可接种5%羊血琼脂、5%兔血巧克力琼脂、中国兰或伊红美兰、葡萄糖肉汤。•2．培养环境：35℃空气环境培养。四.细菌鉴定规范操作1.涂片染色•一．涂片染色：应具备最基本的两种染色技术，即革兰氏染色和抗酸染色。•1革兰染色：革兰染色报告必须包括染色反应或微生物种类和类别，描述物种的形态或结构。如革兰染色见到革兰阳性球菌，呈葡萄状排列；又如革兰染色见到真菌小分生孢子及菌丝。涂片染色•2.抗酸染色：抗酸染色报告应显示找到或未找到或可疑抗酸杆菌三种结果，报告中应以加号体现标本中抗酸杆菌的存在量。如找到抗酸杆菌++；见到染色不典型抗酸杆菌+，建议再送标本。•不能报告找到结核杆菌但可报告未找到结核杆菌2.趋向性鉴定试验•革兰阳性球菌:•触酶试验:3%H2O2用30%的H2O2稀释10倍后使用，避光4度保存；试验时设立阳性和阴性对照；1分钟内产生大量气泡为阳性。•凝固酶试验：采用商品试剂或EDTA抗凝的多个兔混合血浆；测定玻片法测定凝聚因子10秒钟即可观察结果；测定凝固酶需在37度3-4h，若阴性还应放置24h再观察结果。革兰阴性杆菌:氧化酶试验•建议用纸片法保存比较方便；•试剂配制：1%盐酸四甲基对苯二胺水溶液•阳性：由粉红变为蓝紫色为阳性•对照：铜绿假单孢菌ATCC27853+大肠埃希菌ATCC25922-3.血清学试验•肠道致病菌生化特征符合的前提下必须有血清学的试验作最后确认，基层细菌室应具备1-3项血清试剂。血清学鉴定•1.志贺氏菌多价和单价凝集血清：•2.沙门氏菌多价和单价凝集血清•3.致病性大肠杆菌多价和单价凝结血清•4.耶尔森氏菌凝集血清4.真菌鉴定•1．每一基层实验室必须开展真菌涂片，报告临床是否找到真菌；是否见到真菌菌丝；从形态辨别常见丝状真菌;区别曲菌或毛霉菌。•2．开展酵母样真菌分离培养，应具备最基本的沙保弱培养基或用显色培养基，鉴别白念和非白念，隐球菌等。•3.有条件的实验室应开展非培养的鉴定方法，如-D葡聚糖的检测。真菌概述•真菌的基本结构：菌丝和孢子•菌丝：有隔、无隔，形态鹿角状菌丝真菌丝厚膜孢子关节孢子及菌丝芽生孢子五.药敏试验的规范操作•1.用CLS指南推荐的K—B药敏标准进行常规药敏试验判断。•2.根据CLSI更新及时替换应用的标准。•3.根据CLSI推荐的方法，开展重要耐药菌的检测，如MRSA、VRE、HLARE、ESBL。－纸片扩散法操作步骤制备接种物（0.5麦氏单位）接种（15分钟内接种，涂抹均匀）在接种好的琼脂平板上贴加纸片孵育（15分钟内反转平板，35°C空气孵育）苛养菌5％CO2孵育判度结果和解释结果AST－纸片扩散法判读结果将游标卡尺置于反转的平板的背面，测量到最接近的整数毫米数。平板应距离一个黑色不反光的背景数英寸，并用反射光照明。如果是加血的琼脂培养基，则应在透射光照射下，打开培养皿盖，从上表面测量抑菌圈。如果被测菌是葡萄球菌或肠球菌，则应孵育24小时，再在透射光下分别观察苯唑西林或万古霉素的透明抑菌圈内有无耐甲氧西林或耐万古霉素菌落的微弱生长。ESBL初步筛选实验头孢泊肟10ugor头孢他啶30ug氨曲南30ugor头孢噻肟30ug头孢曲松30ug药敏纸片头孢泊肟抑菌圈=17mm*头孢他啶抑菌圈=22mm氨曲南抑菌圈=27mm头孢噻肟抑菌圈=27mm头孢曲松抑菌圈=25mm结果判读M-H琼脂培养基初步筛选实验方法ESBL确认试验ESBL的质控频率•筛选试验和表型确证试验均可每日进行或每周进行，所选择菌株为肺克700603或大肠埃希菌25922。•应该注意的是：肺克700603ESBL基因在质粒上，应将其冻存于-60℃或以下。奇异变形杆菌ESBL监测试验不适用不适用Ceftriaxone127CefotaximeNANAAztreonam122Ceftazidime1*22*Cefp