组合靶基因传感器芯片及自动检测仪

基因芯片技术及临床应用府伟灵西南医院检验科2一.概述随着人类基因组测序计划的逐步实施以及分子生物学相关学科的迅猛发展，越来越多的动植物、微生物基因组序列得到测定。在GenBank数据库中已含有300万个序列，总数超过22亿个碱基对，其中包括19种不同生物体的完整序列、近9000个已知功能或已推测功能的人类基因序列。基因序列数据库正在以前所未有的速度迅速增长。3然而如何充分利用新序列信息资源，怎样去研究如此众多基因的生物信息及其在生命过程中所担负的功能，成为生命科学工作者的共同课题。4已建立的诸如Northern印迹、RNA酶保护实验、S1核酸酶分析、噬斑杂交以及狭线印迹等方法不能提供足够通量来有效地利用新的基因组学的资源。为此，必须发展高通量或平行监测基因表达的新方法。基因芯片技术正是在这样的背景下应运而生。5早在80年代初期，有人就曾设想利用计算机半导体技术生产基因芯片以对人类基因大量的遗传信息进行分析和检查。但直到1994年Pease等人创造的光导原位合成高密、微化的寡核苷酸阵列(ODTA)的制作技术问世之后，才使该设想逐步成为现实。因此可以说光导ODTA化学合成法，为基因芯片技术奠定了基础。7现在全世界已有十多家公司从事基因芯片研究和开发工作，而且已有较为成型的产品和设备问世。这些公司主要以美国的Affymetrix公司为代表。图片来自益来基因网:美国“Fortune”杂志在1997年3月对基因芯片技术未来产业化的前景进行了重点介绍。8二.基因芯片的定义又称DNA芯片，是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上，然后与待测的标记样品的基因按碱基配对原理进行杂交，再通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作出比较和检测，从而迅速得出所要的信息。9三.基因芯片相关技术及其进展基因芯片制备技术靶基因的制备杂交和检测基因芯片设计杂交图像分析……PCR扩增靶基因标记原位合成合成点样芯片杂交杂交检测数据分析实际应用提出问题芯片设计芯片制作试样处理表达差异分析多态性分析再测序生物信息学数学优化数据库标准化10111.基因芯片的主要类型基因芯片视分类方法不同可分为不同类型探针阵列形式原位合成合成点样光引导聚合法喷墨打印合成法（压电打印法）片基或支持物无机芯片有机合成物芯片12基因芯片的主要类型及其简要特点132.基因芯片的制备基因芯片的实质是高度集成的寡核苷酸阵列制造基因芯片首先要解决的技术问题就是如何在芯片片基上定位合成高密度的核酸探针14原位合成•直接在芯片上用四种核苷酸合成所需的探针合成点样•将已经合成好的探针定位在芯片上基因芯片制备的两种基本方法原位光刻合成由美国Affymetrix公司开发AffymetrixWebsite::把玻璃基片上的活性羟基修饰上光保护基团，此光保护基团可被一定波长的光激活并脱保护。2.根据所要制作的阵列的需要设计光刻掩膜。将掩膜（M1）覆盖在修饰过的基片上，用光照射使曝光区域的基片表面脱除保护基团而形成活性羟基（1-2）。步骤3.引入5`端被X基团保护、3`端被活化的单核苷酸dNTP，使dNTP的3`端与基片上的活性羟基缩合，洗去未有效结合的dNTP（3）。4.更换掩膜M2，重复1-2，直到所需要的探针阵列合成完毕（4-6）。使用多种掩盖物能以更少的合成步骤生产出高密度的阵列，在合成循环中探针数目呈指数增长。某一含ｎ个核苷酸的寡聚核苷酸，通过4×n个化学步骤能合成出4n个可能结构。例如：一个完整的十核苷酸通过32个化学步骤，8个小时可能合成65,536（即216）个探针。PictureFromBROWNLAB原位喷印合成芯片原位喷印合成原理与喷墨打印类似，不过芯片喷印头和墨盒有多个，墨盒中装的是四种碱基等液体而不是碳粉。采用的化学原理与传统的DNA固相合成一致，因此不需要特殊制备的化学试剂。PicturefromBioDot:根据所需微阵列，设计有凹凸的微印章，然后根据预先设计在制备的各级印章上涂上对应的单核苷酸。2.按照设计的顺序将不同的微印章逐个依次压印在同一基片上，得到256×256阵列的高密度基因芯片。图片来自益来基因网:*256分子印章阵列显微图（0.18%)高密度芯片DNA阵列显微图（0.16%）高密度芯片DNA阵列荧光杂交图（0.09%）图片来自益来基因网:分子印章多次压印合成法点样机采用了平面微细加工技术，可实现大批量生产。通过提高集成度，降低单个芯片的成本可组装大量的（104--106种）生物分子探针，获取信息量大，效率高，特别适合于基因信息的采集。结合微机械技术（MEMS），可把生物样品的预处理，基因物质的提取，扩增，以及杂交后的信息检测相集成，制备成微物芯片。优势与特点高密度——分辨率高准确性——合成产率高一致性——工艺最优化批量化——平面印刷法合成点样合成点样技术在基因芯片尚处于实验研究阶段时是唯一的芯片制造手段，曾一度被原位合成技术的光芒所掩盖。随着原位合成技术缺点的暴露和自动化技术的进步，合成点样技术又重现生机。是将合成好的探针、cDNA或基因组DNA通过特定的高速点样机器人直接点在芯片上。目前，除Affymetrix等研究和生产基因芯片的少数大公司使用原位合成外，其他中小型公司和实验室研究中仍然普遍采用合成点样法。微型机械点样法化学喷射法＋微型机械点样法该技术由Shalon和Brown于1995年发展起来的另一类具有生命力的基因芯片制备技术。美国Synteni公司最终发展出商品仪器，完成其商品化。通过毛细作用使用点样针将生化物质转移到固体基底表面（点样针与基底表面接触）。第一轮结束后，清洗点样针进行下一轮操作。机器人控制系统可使其实现自动化生产。方法与步骤化学喷射法此种方法先进之处在于采用了压电和其他推动方式从微型喷嘴向固体表面转移生化成分。该技术正由IncytePharmaceuticals(PaloAlto,CA,USA)和Protogene(PaloAlto,CA,USA)等几处中心进行发展。用与压电接口（方型）相连的微型喷嘴将生化物质喷向基底，通过电流控制使样品体积得到精确控制。第一轮结束后，清洗喷嘴进行下一步。方法与步骤30芯片制作工艺的进展1980年Bains等将预先合成的短DNA片段固定在固相支持物上进行的杂交测序实验是基因芯片的最原始模型，所以合成点样是基因芯片制作的最原始的方法由Affymetrix公司发展起来的光导ODTA合成照相平板印刷术将基因芯片引入了工业化生产的阶段。31将样品处理、芯片杂交和信号检测集于一体的所谓“缩微实验室”逐渐成为基因芯片发展的新趋势。在这方面主要有以下技术较为成功：•电子芯片•三维芯片•流过式芯片•石英谐振芯片32电子芯片片基为带有正电荷的硅片，硅片经热氧化，制成1mm2的阵列，每个阵列含多个微电极，在每个电极上通过氮化硅沉积和蚀刻制备出样品池。将链连有亲和素的琼脂糖覆盖在电极上，在电场作用下预先合成的生物素标记的探针即可结合在特定电极上。AVIfromNanogen::最早由美国Nanogen公司开发，目前国内清华大学和复旦大学也在开发这一技术。最大特点：杂交速度快，可大大缩短分析时间。最大不足：芯片制备复杂、成本较高。三维芯片片基上为大量的微小聚乙烯酰胺凝胶条，每个凝胶条可用DNA分析。先把已知化合物加在凝胶条上，用3cm长的微型玻璃毛细管将待测样品加到凝胶条上。35凝胶条的三维化能加进更多的已知物质，增加了敏感性。可以在芯片上同时进行扩增与检测。是该技术不仅可以用于基因芯片，也可以制作蛋白芯片。美国的Packard、摩托罗拉、Argonne国家实验室三家机构与俄罗斯Engelhardt分子生物学研究所合作开发。应用优势36流过式芯片在芯片片基上制成格栅状微通道，将预先设计及合成的特定寡核苷酸探针结合于芯片上微通道内的特定区域。PicutrefromUKMSTSSuimmitConference:从待测样品中分离DNA或RNA并对其进行荧光标记。将标记的靶核酸样品流过芯片，固定在芯片上微通道内的寡核苷酸探针捕获与之相互补的靶核酸。PicutrefromUKMSTSSuimmitConference:特点敏感性高，由于寡核苷酸吸咐表面的增大，流过式芯片可监测稀有基因表达的变化。速度快，微通道加速了杂交反应，减少了每次检测所需时间。价格降低，由于采用了特殊的共价化学技术将寡核苷酸吸咐于微通道内，使每一种流过式芯片可反复使用多次，从而使其成本降低。GeneLogic正在开发靶基因样品的制备靶基因的制备需要运用常规手段从细胞和组织中提取模板分子，进行模板的扩增和标记。靶基因样品的制备方法将根据基因芯片的类型和所研究的对象（如mRNA、DNA等）而决定。403.1靶基因的制备核酸样品制备是基因芯片分析的必须步骤，传统的化学提取法比较费时，不能满足基因芯片对快速高效的要求。因而，人们发明了与芯片相结合的核酸提取方法。•芯片微过滤法•生物电子芯片法41宾夕法尼亚大学的研究小组针对人白细胞的分离设计的一种核酸样品制备方法。微过滤芯片是通过在硅片上刻出几个微米大小的各种形状的过滤微通道，再在硅芯片上加上一块玻璃盖片而成。发展经历了竖式Z型结构、竖式条状梳式结构到最终的横坝式结构。芯片微过滤法42为了把不同的癌细胞、细菌或病毒从血清、水样或其他液体样品中分离而设计的用作介电电泳的细胞分离方法。通过在硅芯片上制作一系列各种排列的金属电极和在这些电极上施加高频电场，使不同的细胞内感应出偶电极。偶电极的出现反过来使细胞承受正介电力或负介电力，从而使细胞从各种液体样品中分离出来。生物电子芯片法PicturefromNanogenwebsite:公司通过在微过滤芯片的电极上施加一系列高压脉冲对电极上分离得到的大肠杆菌细胞进行进行电子胞解，获得了大肠杆菌细胞内的各种RNA和DNA。PicturefromNanogenwebsite:靶基因的扩增与标记主要采用荧光分子标记：常规标记——在扩增过程中加入含有荧光标记的dNTP（至少一种为荧光标记）。末端标记——直接在引物上标记荧光。454.靶基因的杂交及其信号检测荧光显影法质谱法化学发光法光导纤维法压电石英谐振法……ScanningmRNALabelingHybridizationCellAVIfromNanogen:荧光显影法用荧光素标记扩增后的待测核酸样品，将荧光素标记的待测核酸样品与芯片进行杂交，再洗去未杂交的标记样品，然后用荧光显微镜或荧光扫描仪对芯片进行扫描以采集每点的荧光强度并用电脑进行分析比较。47激光共聚焦荧光检测系统目前应用最广泛的荧光检测系统。芯片倒扣在盛有待检核酸的储液器上，芯片的