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慢病毒(过表达)包装步骤秦超1.转染复苏293T细胞,传2-3代进行转染,转染推荐使用合元公司的慢病毒转染试剂。转染步骤:(以10cm培养皿为例)⑴最好在铺细胞后20h左右进行转染,控制转染前细胞密度70%-90%,保证细胞处于良好的状态,转染前一小时把一半培养基(约5ml)换成新的(含血清,因为此转染试剂不需换液)。⑵加psin10ug,pspax210ug,pmd2.g5ug于800ulopti-mem,混匀⑶加40ul慢病毒转染试剂于800ulopti-mem,混匀,室温静置5min⑷将⑶所得的转染试剂稀释液滴加到⑵所得到的质粒稀释液中,边加边轻轻混匀,室温放置20min⑸取出细胞培养皿,将⑷得到的质粒转染试剂复合体加入到细胞培养基中,前后轻轻推摇使混合均匀,放回培养箱。2.收毒(36-48h)收毒前如果质粒带有荧光标签可先看一下转染效率,一般达到60%即可。⑴将培养皿中的病毒上清液吸出到15cm离心管中,然后2000rpm离心10min,以沉淀细胞碎片。⑵取上清用0.22um滤清过滤到浓缩管(用蛋白质浓缩管即可)中。4000rpm离心至所需体积。⑶浓缩完毕后,吸出浓缩后的病毒液,按每次的接毒量分装,-80℃冻存。由于反复冻融会降低慢病毒滴度,因此避免反复冻融。3.接毒接毒前12-20h铺细胞,使接毒时细胞密度约为40%-50%,务必使用生长状态良好的细胞。将分装好的慢病毒滴加到细胞中,加polybrene使其终浓度为8ug/ml细胞密度60%-70%时可以再接毒一次。4.检测及培养细胞系(48h)如果带有荧光标签可直接显微镜看一下感染效率,如需用药杀用puromycin杀三天(对照组完全杀死),剩下的即为基因整合进去的细胞。如需培养成细胞系,可继续培养。如果剩下的细胞较少可用高浓度血清,待细胞聚团时用胰酶消化一下,使细胞铺匀。
本文标题:慢病毒(过表达)包装步骤
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