MolBio-1

第一章遗传的物质基础证明遗传物质的经典实验证明遗传物质的经典实验DNADNA结构类型结构类型DNADNA的复性动力学的复性动力学核酸分子杂交技术核酸分子杂交技术生物的基本属性－遗传和变异孟德尔“遗传因子”摩尔根“基因论”DNA是遗传信息的携带者¾¾19281928：：GriffithGriffith体内转化实验证明遗传物质是体内转化实验证明遗传物质是DNADNA¾¾19441944：：AveryAvery实验证明实验证明转化因子是转化因子是DNADNA第一节什么是遗传物质体内转化实验体内转化实验1928年，英国微生物学家Griffith.F做了肺炎双球菌的转化实验。证明遗传物质是证明遗传物质是DNADNA的实验的实验19441944年年AveryAvery等等揭开了转化因子的化学本质。揭开了转化因子的化学本质。体外转化实验体外转化实验噬菌体的侵染标记实验噬菌体的侵染标记实验－－DNADNA是遗传物质的证明是遗传物质的证明1952年，Hershey和Chase噬菌体感染实验：噬菌体中：DNA唯一含磷物质蛋白质唯一含硫物质实验：放射性培养基培养噬菌体吸附细菌捣碎离心19521952年年HerseyHersey和和ChaseChase的同位素标记侵染实验。的同位素标记侵染实验。噬菌体的侵染实验噬菌体的侵染实验TMV重建实验RNA可以作为遗传物质吗？TMVTMV（（TobaccomosaicvirusTobaccomosaicvirus））组成：组成：5%RNA,95%5%RNA,95%蛋白质蛋白质19561956年，年，GiererGierer和和SchraimSchraim进行了进行了TMVTMV中中RNARNA和和proteinprotein的分离实验的分离实验RNARNA杂合病毒实验杂合病毒实验19571957年，年，HeinzHeinzFraenkelFraenkel--ConratConrat和和B.B.SingreSingre的的杂合病毒实验杂合病毒实验HR(HolmesRibGrassStrain)M(MaskedStrain)TMVHR(HolmesRibGrassStrain)M(MaskedStrain)TMV¾¾信息量大信息量大,,分子量大分子量大¾¾双螺旋结构双螺旋结构,,能自我复制能自我复制¾¾22’’脱氧脱氧,,稳定性好稳定性好¾¾易突变易突变¾¾有有T,T,无无UUDNADNA作为遗传信息的原因作为遗传信息的原因思考：思考：RNARNA为什么不如为什么不如DNADNA稳定？稳定？是否存在核酸以外的遗传物质？是否存在核酸以外的遗传物质？AGGTCGCAGCAGGUCGCAGC脱氨基AGGTCGUAGCAGGUCGUAGC修复AGGTCGCAGCAGGCCGCAGC脱氨基不能辨别DNA分子中有T无U的优势LeveneLevene的四核苷酸假说的四核苷酸假说19501950年年ChargaffChargaff.E.E发现发现ChargaffChargaff定律信息定律信息¾¾当量定律：当量定律：AA＋＋G=T+CG=T+C¾¾DNADNA碱基组成具有物种特异性，碱基组成具有物种特异性，而无组织特异性而无组织特异性四核苷酸假说被推翻四核苷酸假说被推翻DNADNA双螺旋发现的证据双螺旋发现的证据¾¾19501950年年ChargaffChargaff的当量定律。的当量定律。¾¾19511951年年PaulingPauling等有关等有关αα螺旋结构文章。螺旋结构文章。¾¾19521952年年R.FranklinR.Franklin和和WilkinsWilkins一张清晰的一张清晰的DNADNA结晶结晶XX衍射照片。衍射照片。¾定义：核苷酸排列顺序，或称碱基排列顺序。核苷酸排列顺序，或称碱基排列顺序。5’-ATCGGCTAAGGCTCCGACGA--3’3’-TAGCCGATTCCGAGGCTGCT--5’¾人类基因组计划（1990-2005）20世纪生物学最宏伟计划：人类基因组的作图与测序计划耗资30亿美圆，人类基因组有30亿碱基对的测序。第二节DNA结构一.DNA的一级结构¾¾核酸的语言还不能描述整个生命活动的规律核酸的语言还不能描述整个生命活动的规律¾¾一个基因对应一个蛋白质一个基因对应一个蛋白质的经典理论已经被否定的经典理论已经被否定¾¾一个基因可以表达的蛋白质的数目可能远大于一个基因可以表达的蛋白质的数目可能远大于ll：：细菌：可能表达的蛋白质数目为细菌：可能表达的蛋白质数目为1.21.2--1.31.3酵母：酵母：33人：人：可能更高可能更高后基因组研究任重道远后基因组研究任重道远仅用在基因编码的蛋白质中，酶占了大约为仅用在基因编码的蛋白质中，酶占了大约为60%60%。。因此，后基因组研究，亦即功能基因组研究中，因此，后基因组研究，亦即功能基因组研究中，酶蛋白质组研究的任务极为繁重。酶蛋白质组研究的任务极为繁重。DNA的一级结构5’3’方向判断DNADNA的碱基组成的碱基组成二.DNA的二级结构¾定义：DNA的二级结构就是双螺旋结构。¾影响因素：离子类型、离子强度、特异结合蛋白、水合状态以及DNA分子碱基的组成都可促使DNA分子取不同的构象.¾DNA分子存在二级结构多种构象B型结构：B-型结构也称右手双螺旋结构。53年由Watson和Crick首先提出。水溶液（或相对湿度92%以上）中的主要构象。¾右手双螺旋¾两条链反平行¾磷酸,核糖在外侧,碱基在内侧.¾一周螺旋,10个碱基,螺距3.4nm¾遵守AT,CG配对规律¾双螺旋分子存在大沟,小沟B-型DNA构象的主要内容¾A型结构：相对湿度75%,矮胖型,直径大¾Z型结构：Wang等人在研究人工合成的d(CGCGCG)单晶的X-射线衍射图谱发现主链呈锯齿排列。¾Z型结构实验依据:免疫原性SV40调控区其他二级结构Z-型构象的主要特征¾糖-磷酸主链的走向呈之字形,分子呈左手螺旋构象每一螺圈含12对碱基,距离为4.46nm。¾糖环折叠不同于A或B型DNA,鸟嘌呤碱基绕糖苷键旋转呈顺式构型,而嘧啶碱基仍是反式构型,前者的糖环折叠是C3-endo,后者是C2-endo.核苷的顺反构象示意图核苷的顺反构象示意图Z-DNA仅有一条小沟,且较深,含有较高的负电荷密度.Z-DNA较B-DNA细而“舒展”,螺旋直径为1.8nm,B型与Z型DNA结构比较翻板假说示意图¾B型DNA向Z型DNA转化因素原则：降低磷酸基团的排斥作用转化因素：DNA分子中碱基组成及顺序：polyCG组蛋白、鱼精蛋白、聚精氨酸DNA构象家族：A、B、Z都不是单一的构象家族三种构象特征的比较大沟和小沟的信息区别氢键O,N,氢键受体aNH2氢键供体dA-T：大沟(a-d-a)小沟(a-a)G-C：大沟(a-a-d,d-a-a)小沟(a-d-a)DNA二级结构的其他构象¾回文序列－反向重复中的序列：5GGTACC33CCATGG5¾十字型---反向重复序列不一定完全相同：¾生物学功能：限内酶位点RNA转录的终止tRNA环DNA的四链结构¾鸟嘌呤四联体¾非正常的G-G氢键¾糖苷键为反式构想¾平行排列生物体中可能存在G四联体的依据¾端粒：polyTnGn¾酵母抽提液:存在G四联体为底物的酶最初发现:一条全嘌呤,另一条全嘧啶.特征:™两条全嘧啶链和一条全嘌呤链组成™三螺旋结构™氢键为Hoogsten氢键™第三条链位于正常双螺旋的大沟中pyrimidinepurinepyrimidinepurine••PyPy--PuPu--PyPy构象构象((如如TT--A.T,CA.T,C--G.CG.C++))••PuPu--PuPu--PyPy构象构象((如如A.AA.A--T,G.GT,G.G--C)C)三螺旋DNAƒ海胆组蛋白基因间隔序列ƒD(GA)16对S1核酸酶敏感。ƒH离子起稳定作用H-DNA：三.DNA的三级结构—超螺旋结构形成条件：cccDNA63年发现¾类型：正超；负超；松弛型¾性质的变化：沉降系数电泳迁移率¾生物学意义：包装；解链超螺旋结构类型同一分子不同类型DNA的性质类型拓扑结构沉降系数电泳迁移率闭环超螺旋1.41最快闭环松弛型1.41最慢开环松弛型1.14很慢线型松弛型1.00中等¾链环数（Linkingnumber)表示超螺旋的的拓扑性质。指一个环状封闭双螺旋DNA分子两条链彼此交叉的次数。¾L=W+T¾T：代表双螺旋中的罗圈数，数量=总碱基数/每一罗圈的碱基数。¾W：超螺旋的程度，双螺旋中心轴盘绕的圈数。松弛分子的W值等于零。带子模型举例：一个200bp的环状闭合双链DNA¾松弛型，没有超螺旋。W=0L=W+T=0+200bp/10bp＝20¾负超螺旋形成1个超螺旋W=-1L=W+T=-1+200bp/10bp=19¾正超螺旋形成1个超螺旋W=+1L=W+T=1+200bp/10bp=21超螺旋的量度可以用超螺旋密度超螺旋的量度可以用超螺旋密度λλ来表示来表示：：λλ==（（LL--TT））/T/T在天然在天然DNADNA中，中，λλ约为约为--0.050.05带子模型实例¾拓扑异构体:Topologicalisomers具有完全相同的碱基顺序,但L值不同的超螺旋.¾拓扑异构体的互变由拓扑异构酶催化。发生一条链或两条链的断开和连接。¾拓扑异构酶类型：I,II型两种拓扑异构体TopoisomeraseI：¾C型酶¾切一条链；¾不需能量；¾对正超无作用TopoisomeraseI作用机理TopoisomeraseII：¾切两条链；¾需能量；¾可作用于正超¾亚基的变构作用TopoisomeraseII作用机理形成正超SV40DNA：负－松弛－正溴乙锭作用¾呼吸作用的定义：氢键的迅速形成和再生¾甲醛的变性实验：甲醛只能与DNA上自由的氨基起作用，键处于动态平衡。第三节DNA双螺旋的呼吸作用1.451.0024A260含有4％甲醛的DNA溶液的变性图（温度为25度）小时¾碱基对的组成和排列顺序影响从嘌呤到密啶方向碱基堆积力强¾生物学作用：A-T富含区往往是复制、转录的起碱基对结构的稳定性-40-36-32-280-20-40-6015010050Tm(‘C)堆集能（kJ/mol)ΔHm(kJ/mol)A·TA·TA·TT·AG·CT·AG·CA·TT·AA·TG·CG·CG·CC·GA·TG·CC·GA·TC·GG·C¾变性在某些物理化学因子的作用下，DNA双链间的氢键断裂，双链解离形成单链。第四节DNA的变性复性和分子杂交性质变化¾增色效应*¾黏度降低¾沉降速度增加热变性曲线可描述热变性过程DNA变性后性质变化1.41.31.21.11.0TmOD708090100温度（‘C）¾融点Tm50%DNA分子解链时的温度。融点与DNA分子中的GC有关¾化学因素甲酰胺破坏氢键常用的DNA制备单链法：pH大于11或盐浓度小于0.01M热变性缺点¾温度温度升高引起的DNA变性称热变性加热使氢键断裂。影响DNA变性的因素657585°CA2601.41.31.21.1[GC]=35%50%66%复性去除变性条件后，单链DNA在适当条件下重新形成双链，回复到原有的物理和生物学特性。¾盐：0.15-0.50MNacl¾T:Tm-20度Tm=69.3+0.41(G+C)%Tm=69.3+0.41(G+C)%或或GC%=GC%=（（TmTm--69.369.3）×）×2.442.44复性复性过程是两条单链DNA碰撞形成双链DNA的过程，是双分子反应。服从二级反应动力学规律：dC/dt=-KC2C为t时单链DNA浓度，K为复性常数。复性动力学¾控制复性反应参数Co，t¾C0t1/2:复性反应进行到50%时的C0.t为C0t1/2¾DNA复杂性：最长的没有重复序列的Nt的数值复性动力学公式推导C11C021+KC0t1/2==在固定的实验条件下，C0t1/2与DNA复杂性成比例C0t曲线：用已经复性的DNA浓度，即1－C/C0对C0t1/2的对数作图。方法：减色效应羟基磷灰石S1酶水解C0t曲线¾每一种曲线的形