革兰阴性杆菌耐药性检测进展

革兰阴性杆菌耐药性检测进展华鑫科技有限公司技术部吕苏成2005、09前言•革兰阴杆菌是院内感染的重要病原菌，在感染中常居首位，由于其具有多重耐药，而且耐药率高，特别是对第三代头孢菌素和单环酰胺类等新的广谱菌药耐药，给临床治疗带来很大困难，为止引起了国内外学者的高度关注，他们在研究简便、快速检出方法及其耐药机理和选择治疗用药等方面取得了很大进展，并已不少报道。一、G-b的耐药机理•1.细菌产生ß-内酰胺酶可水解ß-内酰胺酶类抗生素，这是昀重要和昀常见的耐药机制。细菌产生氨基糖苷类钝化酶对氨基糖苷类如庆大酶素耐药，喹诺酮类耐药是由于DNA旋转酶改变或药物渗透性改变。•2.抗生素的渗透障碍：由于细胞壁障碍或细胞膜通透性改变抗生素无法进入菌体内发挥抗菌作用，当细菌外膜微孔蛋白缺失后抗生素也不能进入菌体。•3.外膜存在着药物泵出系统（Tet膜蛋白介导）使进入菌体内的药物主动泵出导致菌体内药物浓度降低，如对四环素类和喹诺酮类耐药等。•4.靶位的改变：ß-内酰胺酶类抗生素通过与青霉素结合蛋白（PBPs）结合而抑制细菌生长，当靶位改变后抗菌药物不能与其结合而失去作用。对磺胺耐药是由于细菌改变体内二氢叶酸和合成酶，与磺胺药的亲和力降低引起的。•5.非水解屏障机制：主要是染色体介导的1型ß-内酰胺酶细菌如绿脓杆菌，肠杆菌等对头孢类抗生素耐药并非抗生素的ß-内酰胺环水解，而是由于非水解屏障的形成，由于ß-内酰胺酶类药物与质周空间诱导产生的ß-内酰胺酶结合成无生物活性的复合物而不能进入靶位发挥抗菌作用。•细菌同时具有以上两种以上耐药机制就产生了对多种抗生素的耐药性。•二、新型ß-内酰胺酶的产生、传播，增加了G-杆菌的耐药性。•1.60年代初期从大肠杆菌中首次发现质粒介导的tem-1ß-内酰胺酶，随后在全球转播并在许多不同菌株中发现如肠杆菌科，铜绿假单胞菌等。•2.70年代开始，一些新的ß-内酰胺类抗生素应用于临床，试图来治疗一些革兰阴性杆菌引起的感染，因为这些细菌已对同类旧的一代抗生素产生了耐药性。这些新的药物包括第二、三代的头孢抗生素，如头孢呋新（cefuroxime）、头孢孟多（cefamandole）、头孢噻肟（cefofaxime）、和头孢他啶（ceftazidime），以及单酰胺菌素胺曲南。在新的ß-内酰胺类抗生素广泛使用后，出现了耐授这些新药的肺炎克雷伯菌。由这些异常耐药菌株所造成的感染也随之出现。•这种耐药性也播散到大肠埃希菌的某些菌株，还有少数其它革兰阴性杆菌。对这种耐药性产生机制的调查结果显示，由旧质粒介导的TEM和SHVß-内酰胺中还存在新型式的酶。旧酶的结构基因编码发生突变，产生比亲代酶具有更广谱底物的衍生物。这些具有超广谱作用底物的新的酶包括第二、三代头孢类抗生素和胺曲南。因此它们被命名为超广谱ß-内酰胺酶（ESBLs）。•随着80年代初期发现产ESBL菌株。在80年代后期由于ß-内酰胺类抗生素与ß-内酰胺酶抑制剂联合应用不断增加，出现了耐抑制剂ß-内酰胺酶（Inhibitor-resistantß-Lactamases），研究发现耐克拉维酸的ß-内酰胺酶核酸序列是TEM-1或TEM-2的变种，称为IRT（InhibitorresistantTEMß-Lactamases）。•以后用数字来表示如TEM-30为IRT-2，TEM-31为IRT-1，TEM-2为IRT-3等，共有IRT-23种；还有SHV-1的变种和相关的酶。耐抑制剂ß-内酰胺酶菌株有大肠埃希菌，肺炎克雷伯菌，产酸克雷伯菌，奇异变形杆菌和弗劳地枸橼酸杆菌。这些细菌对阿莫西林/克拉维酸，替卡西林/克拉维酸和氨苄西林/舒巴坦耐药。•90年代初期因头霉素如头孢西丁应用增多出现了质粒介导的AmpC酶，对头霉素耐药。•90年代后期因碳青霉稀酶，对碳青酶稀类抗生素耐药。新酶的产生导致了G-杆菌耐药谱的变化，并对多种超广谱抗生素耐药。一、超广谱ß-内酰胺酶（ESBLs）•ESBLs（ExtendedSpectrumß-lactamases）特性：•ESBLs是丝氨酸蛋白酶的衍生物能于ß-内酰胺环的羧基共价结合使酰胺键水解，可水解青霉素类，头菌孢素和单环酰类抗生素，特别是能水解第三代，如头孢他啶、头孢噻肟等和水解单环酰胺类，如氨曲南等并对四代头菌孢素如马斯平也能部分水解。ESBLs是质粒介导的能被克拉维酸抑制，不被EDTA抑制。二、ESBLs产生机制•ESBLs的产生是由于第三代头孢菌素的广泛应用，药物选择性压力导致广谱ß-内酰胺酶TEM-1，-2或SHV-1基因突变。1982年英国报道一株产TEM-1产酸克雷伯菌昀初庆大耐药，对孢头他啶敏感，使用孢头他啶后对其耐药，基因分析发现TEM-1结构中第164位上精氨酸变为丝氨酸，命名为TEM-12。1983年德国首例报道的产ESBLs臭鼻伯菌在SHV-1第238位上的甘氨酸变成了丝氨酸，SHV-2。总之ESBLs是在TEM-1，-2或SHV-1结构中的少数位点1-4个氨基酸发生基因突变，使其产生ESBLs表型。三、ESBLs在ß-内酰胺酶中的位置•根据Bush，Rasussen和Ambler等提出的ß-内酰胺酶的分类法具体见下表：功能表分子分类ß-内酰胺酶种类作用昀佳底物被抑制棒酸EDTA代表酶–+诱导酶来自肠杆菌、枸缘酸杆菌、沙雷菌和假单胞菌、质粒介导的酶ACT-1、CMY型、FOX型金葡菌PCI青霉素酶TeM-1、-2、SHV-1、OHIO-1TEM-3、-10、-26、其他TEM；SHV-2、-5、-7、其他SHV；CTX-M-1CTX-M-9，产酸克雷伯K1TEM-30到TEM-36，其他SHV；SHV-102cA水解羧苄西林，ß-内酰胺酶青霉素，包括羧苄青霉素+–PSE-1，PSE-3，PSE-4；气单胞AER-1；CARB-3、-4+–+–+–––头孢菌素类青霉素类青霉素和窄谱头孢菌素青霉素，所有头孢菌素和单环酰胺类青霉素和窄谱头孢菌素类AmpC型ß-内酰胺酶G+青霉素酶广谱酶超广谱ß-内酰胺酶耐ß-内酰胺酶抑制剂CAAAA12a2b2be2br功能表分子分类ß-内酰胺酶种类作用昀佳底物被抑制棒酸EDTA代表酶2dD水解苯唑青霉素，ß-内酰胺酶青霉素类包括氯唑西林±–OXA-1到OXA-302eA被棒酸抑制的头孢菌素酶头孢菌素类+–脆弱类杆菌CepA，变形杆菌FPM-1，嗜麦芽窄食单胞菌L22fA非金属碳青酶稀酶青霉素头孢菌素类和碳青酶稀类+–IMI-1，NMC-ASme-13aB金属ß-内酰胺酶青霉素类，头孢菌素类，碳青酶稀类+–腊样芽孢杆菌11，CcrA、IMP-1、L1、VIM-1、VIM-23bB金属ß-内酰胺酶碳青酶稀类–+Cph、AsbM1、ASA-1、ImiS3cB金属ß-内酰胺酶头孢菌素类碳青酶稀类–+ß-内酰胺酶来自高曼军团菌4ND不被棒酸抑制青霉素酶青霉素类––ß-内酰胺酶来自洋葱伯克霍尔德菌，SAR-2ß-内酰胺酶的命名•根据作用的底物如CARB、IMP、OXA、CAI、CTX等；•根据生化特性如SHV；•根据基因如Amp、CepA；•根据细菌如AER、PSE；•根据患者名如TEM、ROB；•根据医院如MIR、RHH、州名（OHIO）等命名（四）ESBLs种类•ESBLs现有TEM、SHV、CTX酶，CTX酶为一种新型酶。•1、TEM酶有90多种其中ESBLs63种，IRT23种，有些TEM酶有替代名称，如TEM-5为CAZ-1，TEM-8为CAZ-2，TEM-16为CAZ-7，TEM-25为CTX-2，TEM-35为IRT-4等。•2、SHV酶有30种，其中ESBLs24种，4种还未报道。•3、CTX酶为一种新型酶，CTX-M-1到CTX-M-9，这些酶与TEM和SHV酶没有密切关系，CTX-M-2为昀常见流行的ESBL。•OXA（苯唑西林）酶中发现有几个型是ESBLs，OXA酶属于Bush分类D组2d型。OXA-11，-14，-16和-17是OXA-10的衍生物，OXA-2是OXA-2的衍生物。这组ESBLs菌株对头孢菌素弱耐药。（五）产ESBL菌株•1、肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌是昀常见ESBLs菌株，从产酸克雷伯菌，阴沟肠杆菌，产气肠杆菌，沙雷菌和奇异变形杆菌等肠杆菌科细菌分离出产ESBLs菌株。•2、出产ESBLs菌株在全球传播。不同国家和地区都有不同报道，如产ESBLs肺炎克雷伯菌在美国的发生率为3%左右，但有的地区高达25%。荷兰16%，比利时31%，葡萄牙49%，土耳其9%，韩国23%，国内报道6%-57%，在大肠埃希菌中产ESBLs菌株检出率为17-30.2%左右。•产ESBLs菌株ICU病房和老年科发生率高，有报道由ESBLs菌株引起的爆发流行。（六）产ESBLs菌株流行的原因•1、ESBLs是质粒介导的，在一定条件下细菌将耐药质粒转移给同种属或不同种属细菌而传播快。•2、药物选择性压力导致产ESBLs菌株不断增加。•3、医务人员通过手或使用气械传播。•4、患者之间传播。•5、正常人携带也是造成ESBLs传播和感染的重要因素，在芝加哥的老人疗养院中，从半数老人的胃肠道内分离出产ESBLs的肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌。（七）治疗选药和控制措施•ESBLs的质粒上常常携带对其他抗生素如庆大霉素，环丙沙星和磺胺类等耐药基因，造成ESBLs菌株多重耐药。1、ESBLs菌株治疗选药原则•碳青酶稀类如亚胺配能•含ß-内酰胺酶抑制剂复合抗生素，如舒普深，特治星等。•氨基糖苷类抗生素，阿米卡星•头酶稀类抗生素，头孢西丁2、预防措施•控制超广谱抗生素第三代头孢菌素等的使用。•预防自身感染和交叉感染。•发现产ESBLs菌株爆发流行，应该立即采取感染控制的处理方法，如关闭病房彻底消毒等。•发现散发的ESBLs感染株应选择有效药物清除它，对环境要彻底消毒。ESBLs菌株的检测方法•目前检测ESBLs菌株有几种方法（除外分子学方法）都共同应用一个原理，即头孢类抗生素与ß-内酰胺酶抑制剂克拉维酸联合应用，克拉维酸抑制ESBL，细菌对头孢类抗生素减少耐药性。具体检测方法有：1、双纸片协同法•按照标准纸片扩散法操作，在测试菌涂布在M-H琼脂平版上后将含克拉维酸（棒酸）的阿莫西林纸片贴在平板中央，然后在其周围分别贴上头孢他定（CAZ）、头孢噻肟（CTX），氨曲南（AZT）纸片，与含棒酸纸片距离为15mm-20mm（纸片边缘到边缘），放置35℃18h，出现协同现象为ESBLs菌株。在检测大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌时用CTX和AZT较CAZ易于观察结果，试验中发现阴沟肠杆菌中产ESBLs菌株用CAZ优于CTX。因此检测产ESBLs菌株时昀好同时使用CAZ和CTX以利于提高检出率。2、三维试验•什么叫三维？•纸片上的药物向培养基中扩散为一维。•琼脂平板上的细菌产生的抗药性酶向培养基中扩散是二维。•在纸片旁边的琼脂刻一裂缝，在其中加入受试菌液，该菌产生的抗药性酶向四周的琼脂中扩散是第三维。2、三维试验有2种方法•直接法（用同一菌株）•间接法（用不同菌株）直接法•平板表面涂布的细菌和裂缝中的细菌相同，首先按标准纸片扩散法操作，贴上CAZ，CTX，AZT药敏纸片，距离纸片3mm处刻一裂缝加入浓度为103-106cfu/ml菌液，35过夜，抑菌环形状改变为阳性。间接法•平板表面涂布的细菌是用已知对检测用的药物敏感菌株如ATCC25922，裂缝中为受试菌；如果受试菌干扰敏感菌株形成抑菌环的现象为阳性。3、Etest法•按照标准纸片扩散法操作，贴上CAZ/CAZ+CLA、CTX/CTX+CLA等用于检测ESBLs的E-试验纸条，放置35℃18h。结果判读：加克拉维酸的MIC值比不加克拉维酸的MIC值降低3个倍数为产ESBLs菌株。4、自动化仪器•如Vitek-Ams仪器，用专门检测ESBLs的药敏卡进行检测被试菌，仪器自动读取结果。。•5、NCCLs推荐的检测肺炎克雷伯菌，产酸克雷伯菌，大肠埃希菌和2005年NCCLs推荐的检测变形杆菌中ESBLs的筛选和确证试验具体方法有纸片扩散法和稀释法（包括琼脂稀释法和肉汤稀释法）